LOXL2對肝癌血管生成擬態(tài)及臨床預后的影響.pdf

1、研究目的：
　　肝細胞肝癌已位列第二大致死性腫瘤，其高發(fā)病率和高致死率的主要原因是血管侵犯和轉(zhuǎn)移。因此對于腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的進一步研究，將會更好地提升腫瘤的抗血管治療效果，提升肝癌患者的生存質(zhì)量。本實驗檢測LOXL2（lysyl oxidase like2）、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)分子SNAIL、血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，V

2、M）形成的標記蛋白VE-cadherin及細胞極性蛋白LLGL2（Lethal giant larvae2）在肝癌中的表達情況并探討它們之間的關(guān)系；然后分析LOXL2的表達與年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期等各種臨床資料的關(guān)系；探究LOXL2與VM兩者對于肝細胞肝癌（HCC）的生存時間及其臨床預后的影響，從而更好地闡述LOXL2對于肝細胞肝癌VM形成、轉(zhuǎn)移及預后的影響和意義。同時在體外實驗中細胞轉(zhuǎn)染、分子生物學技術(shù)等方法來進一步探究LOX

3、L2對于體外腫瘤細胞的成管、侵襲和遷移能力影響，從而了解其對于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力及VM形成的影響?？傊?，對于LOXL2在肝細胞肝癌 VM形成及臨床預后的影響的初步研究，將會為肝細胞肝癌的診斷治療尋找到潛在的預后預測分子，并為肝細胞肝癌的治療提供一定的借鑒。
　　研究方法：
　　1.收集來自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學總醫(yī)院的201例肝細胞肝癌病例，采用免疫組化方法檢測肝細胞肝癌樣本中LOXL2、LLGL2、SNAIL和

4、VE-cadherin的表達情況并分析他們之間的相關(guān)性，然后采用CD31/PAS雙染的方法檢測肝細胞肝癌中VM的情況并分析VM與其他蛋白表達的相關(guān)性。同時，為了進一步了解肝細胞肝癌組織內(nèi) LOXL2及相關(guān)分子在 mRNA水平的情況，我們針對64例肝癌冰凍組織進行了實時定量PCR（qRT-PCR）的實驗來檢測LOXL2與其相關(guān)基因的表達情況。第二，針對201例臨床病例資料進行回顧性分析，結(jié)合臨床資料通過X2和Spearson相關(guān)分析來研究

5、LOXL2表達與年齡、性別、腫瘤大小、VM形成及臨床分期等臨床資料的關(guān)系；第三，采用判別分析對160例HCC病例建立判別公式，并在剩余60例肝癌病例中，對比分析來檢測LOXL2對于肝癌轉(zhuǎn)移的預測價值；最后，采用Kaplan-Meier來探究LOXL2和 VM形成對于腫瘤患者生存時間及兩者共同對于腫瘤患者生存時間的影響；并采用Cox比例風險模型分析LOXL2對于肝細胞肝癌預后的價值。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選構(gòu)建出LOXL2高表達/降表

6、達的肝細胞肝癌細胞系，進而通過體外三維培養(yǎng)來觀察 LOXL2對于體外 VM形成能力的影響，并通過劃痕、Transwell侵襲等細胞功能學實驗來初步觀察 LOXL2對于腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.針對201例肝細胞肝癌病例的免疫組化結(jié)果顯示：LOXL2在肝癌細胞中的胞質(zhì)和胞核中均表達，SNAIL大部分在肝癌細胞的胞核中表達，LLGL2表達于肝癌細胞的胞質(zhì)，而VE-cadherin在肝癌細胞中的胞核中

7、表達。201例肝細胞肝癌中，LOXL2在胞漿中表達率為52.2％，在胞核的表達率為52.7%；SNAIL陽性率為76.1%；而VE-cadherin陽性率為21.9%；而LLGL2的陽性率為24.3%。相關(guān)性分析顯示：LOXL2漿表達、EMT調(diào)控者SNAIL的核表達及VM的標記物VE-cadherin的漿表達之間分別存在著一定的相關(guān)性（R=0.165 P=0.019；R=0.235 P=0.001；R=0.152 P=0.031；R=0

8、.071 P=0.031）；而LOXL2的核表達，LLGL2的漿表達及VE-cadherin的表達卻與其他蛋白不相關(guān)（R=0.110 P=0.119；R=0.043 P=0.541；R=0.069 P=0.324）。
　　2.qRT-PCR的結(jié)果顯示：結(jié)果顯示：LOXL2、Snail、VE-cadherin等蛋白在肝細胞肝癌組的mRNA表達水平明顯高于其在正常組中的表達水平（P=0.033， P=0.034，P=0.024）。而細

9、胞極性形成的相關(guān)蛋白LLGL2則正好相反（P=0.045）。相關(guān)性分析顯示：在mRNA水平上，LOXL2與SNAIL、VE-cad正相關(guān)，與LLGL2負相關(guān)，這與免疫組化中的相關(guān)性分析是一致的。
　　3.免疫組化CD31-PAS雙染結(jié)果顯示：201例肝細胞肝癌病例中，48的肝癌病例發(fā)現(xiàn)了VM的存在。而153例沒有發(fā)現(xiàn)VM的存在。在VM形成組的48例中，34例的肝細胞肝癌病例中LOXL2漿表達，表達率高達70.8%，而相應(yīng)的無VM形

10、成組153例肝癌病例中，僅有約占46%（71例）的病例呈現(xiàn)LOXL2漿表達。兩組之間存在顯著性差異（p=0.005）；相關(guān)性分析也顯示LOXL2的表達與VM形成呈正相關(guān)的關(guān)系（r=0.209，p=0.003）
　　4.LOXL2的臨床病理資料分析顯示：LOXL2蛋白的漿表達在轉(zhuǎn)移組中的陽性率明顯大于其在非轉(zhuǎn)移組的陽性率。另一個因子 SNAIL作為 EMT的相關(guān)因子在轉(zhuǎn)移組也呈現(xiàn)高表達的水平，且表達水平與非轉(zhuǎn)移組相比具有顯著性差異（

11、P=0.002）。同時LOXL2在病理分級III+IV組中的蛋白表達水平明顯高于I+II組（P=0.002）。即，LOXL2在201例肝細胞肝癌組織中的漿表達與腫瘤分級和轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，而跟病人的年齡、性別及腫瘤大小未見明顯相關(guān)。而跟病人的年齡、性別及腫瘤大小未見明顯相關(guān)（ P=0.302；P=0.337；P=0.388）。同時判別分析顯示LOXL2對于肝癌轉(zhuǎn)移的預測具有很好的價值。
　　5.Kaplan-Meier生

12、存分析顯示：LOXL2漿表達的患者其總體生存時間（OS）和無病生存時間（DFS）明顯地較 LOXL2漿表達陰性的患者短（P<0.005）。VM陽性表達的病例相比于VM陰性表達的病例其總體生存時間（OS）和無病生存時間（DFS）更短（P<0.005）同時具有VM和LOXL2漿表達的病例組，其DFS和OS平均值相比于不是VM形成和LOXL2漿表達的雙陽的病例組明顯較短（P=0.000）。Cox分析顯示：LOXL2漿表達和VM形成是病人整體生

13、存時間（P<0.001; HR=2.155; CI:1.123–4.136; P<0.05; HR=3.378; CI:1.942–5.878， P<0.05）和無病生存時間（P<0.001; HR=1.782; CI:1.037–3.063; P<0.05; HR=3.705; CI:2.282–6.016，P<0.01）的獨立預后因子。
　　6.在體外三維培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示：高表達 LOXL2蛋白的 HepG2-LOXL2上調(diào)細

14、胞系中，細胞在三維實驗中的管道樣結(jié)構(gòu)形成能力明顯較對照組HepG2-control細胞系明顯提升。另一方面在穩(wěn)定降表達 LOXL2蛋白的Bel7402-shLOXL2細胞系，其在三維實驗中的管道樣結(jié)構(gòu)形成能力較對照組呈明顯性降低。
　　7.在體外劃痕遷移和 Transwell侵襲實驗中，高表達 LOXL2蛋白的 HepG2相比對照組細胞系其遷移和侵襲能力明顯提升（ P<0.05）；而經(jīng)轉(zhuǎn)染漿表達LOXL2蛋白的Bel7402-sh

15、LOXL2相比對于對照組的Bel7402-control細胞系其遷移和侵襲能力明顯降低（P<0.05）。
　　8.針對肝細胞肝癌細胞系的實時定量 PCR的結(jié)果顯示：LOXL2mRNA的高表達促進VM形成的標記蛋白VE-cadherin的mRNA水平的表達，并降低細胞極性蛋白LLGL2的mRNA水平的表達（P<0.05），但是對于SNAIL的促進效果卻不明顯；另一方面，LOXL2mRNA的低表達將會抑制VM形成的標記蛋白VE-cad

16、herin的mRNA水平的表達，同時促進細胞極性蛋白LLGL2的mRNA水平的表達（P<0.05），但是對于SNAIL的抑制效果并不明顯；。
　　研究結(jié)論：
　　1. LOXL2漿表達與臨床分級和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而與年齡及性別等臨床資料不相關(guān)。
　　2. LOXL2促進肝細胞肝癌中VM的形成，并與肝癌的不良預后密切相關(guān)。
　　3. LOXL2漿表達和VM形成是病人整體生存時間和無病生存時間的獨立預后因子。