ArgonautE-2蛋白在肝癌血管生成和擬態(tài)中的功能研究.pdf

1、肝癌依然是世界范圍內(nèi)的頂尖癌癥殺手之一，高密度的血管形成不但是肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)誘因，而且還是肝癌組織營(yíng)養(yǎng)供給的主要途徑。諸多關(guān)于血管生成的研究已經(jīng)證實(shí)，血管生成過(guò)程極其復(fù)雜但受到包括VEGF, PDGF, FGF,Endostatin等相關(guān)因子的嚴(yán)密調(diào)控。另外，近年來(lái)的研究也證實(shí)了miRNAs在血管生成中的重要作用。除此之外，腫瘤細(xì)胞自身形成擬態(tài)結(jié)構(gòu)也被證實(shí)和血管生成在轉(zhuǎn)移，血供等方面具有相輔相成的作用。盡管如此，對(duì)惡性腫瘤的血管生成和擬態(tài)

2、過(guò)程相關(guān)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)還有待進(jìn)一步提高。
　　作為miRNAs加工成熟和功能執(zhí)行的重要因子AGO2(Argonaute-2，又稱EIF2C2)蛋白，是AGO家族中唯一具有限制性酶切活性的成員，也是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）的必要催化組分，能通過(guò)多種作用機(jī)制參與非編碼小RNA(small non-coding RNA)誘導(dǎo)的特異性基因表達(dá)負(fù)調(diào)控過(guò)程。近年來(lái)也有研究表

3、明，AGO2在多種惡性腫瘤組織中存在表達(dá)顯著上調(diào)現(xiàn)象，參與多種癌細(xì)胞相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，比如EGFR、AKT3、MAPK、FAK等，在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。已有報(bào)道稱，通過(guò)siRNA技術(shù)抑制人臍靜脈上皮細(xì)胞(HUVECs)中Ago2基因的表達(dá)，能有效抑制其新生血管生成過(guò)程，揭示出AGO2與血管生成兩者之間的直接聯(lián)系。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)AGO2在肝癌組織中存在高表達(dá)的現(xiàn)象，干擾Ago2基因的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的體外增殖沒有顯著影響，但對(duì)肝癌

4、細(xì)胞的移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。
　　因此，在本研究中，利用siRNA干擾技術(shù)對(duì)肝癌細(xì)胞株Huh7和SMMC-7721中的Ago2基因進(jìn)行干擾，在體內(nèi)外檢測(cè)Ago2基因干擾后對(duì)肝癌細(xì)胞的血管生成和擬態(tài)形成能力的影響，并進(jìn)行多方面驗(yàn)證。主要的方法與結(jié)果如下:
　　一、 Ago2基因的干擾對(duì)肝癌細(xì)胞血管形成體外研究
　　采用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建Ago2基因干擾的Huh7，SMMC-7721和對(duì)照的細(xì)胞株（分別命名為Huh

5、7/7721-ctrl/siAgo2），采用RT-PCR技術(shù)在mRNA水平檢測(cè)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)受到顯著抑制。進(jìn)一步采用Westem Blot和ELISA技術(shù)在蛋白水平檢測(cè)AGO2和VEGF在六種肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)相關(guān)性（文中所有統(tǒng)計(jì)學(xué)P值均通過(guò)SPSS18.0軟件采用t檢驗(yàn)和 Pearson卡方檢驗(yàn)算得），驗(yàn)證Ago2基因干擾對(duì)VEGF表達(dá)的影響，并采用與HUVECs細(xì)胞的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)檢驗(yàn)Ago2基因干擾

6、對(duì)肝癌細(xì)胞血管生成因子分泌量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:AGO2和VEGF在肝癌細(xì)胞株中存在顯著的相關(guān)性，Ago2基因的干擾在mRNA和蛋白水平上均能顯著降低VEGF的表達(dá)，并能削弱在共培養(yǎng)情況下肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)HUVECs細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)形成的誘導(dǎo)能力。
　　二、 Ago2基因的干擾對(duì)肝癌細(xì)胞血管生成影響的體內(nèi)研究
　　將數(shù)量1×107的Huh7-ctrl，Huh7-siAgo2和7721-ctrl，7721-siAgo2細(xì)胞分別

7、皮下注射進(jìn)行免疫缺陷型裸鼠移植，每組6只老鼠，注射后12天開始每4天測(cè)量一次腫瘤體積，測(cè)量三周后將所有老鼠脫頸處死，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線分析，移植瘤體總質(zhì)量稱量和拍照，并將所有腫瘤組織浸泡于4％多聚甲醛中保存用于免疫組化檢測(cè)AGO2，CD31和PTEN的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:相比對(duì)照的細(xì)胞來(lái)源移植瘤，Ago2基因干擾的肝癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)速度、體積、重量以及AGO2和CD31的表達(dá)均顯著下調(diào)。
　　三、 AGO2與血管生成相互作用的機(jī)制研

8、究
　　前期研究顯示PTEN在Ago2基因干擾的細(xì)胞中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)PTEN已經(jīng)被普遍證實(shí)是著名的血管生成抑制因子。因此采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Ago2基因干擾后的肝癌細(xì)胞中PTEN的mRNA表達(dá)水平，蛋白免疫印跡、免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)PTEN的體內(nèi)外蛋白表達(dá)水平，并采用不同濃度的PTEN特異性抑制劑BPV培養(yǎng)Huh7/7721-siAgo2細(xì)胞后再對(duì)VEGF表達(dá)及其培養(yǎng)上清誘導(dǎo)微管形成能力進(jìn)行

9、檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:相比對(duì)照細(xì)胞，Ago2基因干擾的肝癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)顯著上調(diào)，當(dāng)抑制PTEN的功能時(shí)，AGO2與VEGF的相互作用也被阻斷。因此，PTEN是介導(dǎo)AGO2與VEGF相互作用的重要調(diào)控因子。
　　四、 Ago2基因干擾對(duì)肝癌細(xì)胞擬態(tài)過(guò)程的影響研究
　　將Ago2基因干擾和對(duì)照的細(xì)胞種植到鋪好Growth Factor-Reduced Matrigel的3D培養(yǎng)六孔板中進(jìn)行擬態(tài)形成過(guò)程體外驗(yàn)證，深度測(cè)序揭示

10、Ago2基因干擾后引起一序列擬態(tài)相關(guān)重要因子的下調(diào)，進(jìn)一步采用RT-PCR，Western Blot、免疫熒光和免疫組化技術(shù)對(duì)AGO2、TWIST1、VE-cadherin、E-cadherin的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Ago2基因干擾對(duì)Huh7、SMMC-7721細(xì)胞的擬態(tài)過(guò)程具有抑制作用，通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)TWIST1的表達(dá)水平也因Ago2基因的干擾受到抑制，蛋白免疫印跡和免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證了AGO2通過(guò)TWIST1調(diào)控肝癌細(xì)胞的擬態(tài)