缺氧在卵巢癌血管生成擬態(tài)形成中的作用研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤首位，預(yù)后差。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry VM)是大多數(shù)高度惡性腫瘤組織內(nèi)普遍存在的一種功能性微循環(huán)形式，指具有可塑性的腫瘤細(xì)胞在沒有內(nèi)皮細(xì)胞參與的情況下，通過基質(zhì)重塑和自身變形形成的微循環(huán)管道。血管生成擬態(tài)的存在也使傳統(tǒng)的腫瘤抗血管治療難以徹底阻斷腫瘤血供，無法有效改善患者的生存率。VM是是腫瘤可塑性的一種表現(xiàn)，目前關(guān)于其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞可塑性出現(xiàn)的分子

2、機制仍不清楚。缺氧是腫瘤血管生成的主要誘導(dǎo)因素，且缺氧微環(huán)境普遍存在于快速增殖的實性腫瘤內(nèi)，因而我們考慮缺氧也極可能是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞可塑性，形成VM的重要因素之一。
　　目的：
　　本研究旨在探討缺氧微環(huán)境在腫瘤血管生成擬態(tài)形成中的作用，及缺氧促進(jìn)腫瘤細(xì)胞形成VM的可能的分子機制。探究缺氧微環(huán)境下腫瘤細(xì)胞形成VM的分子機制有助于完善和發(fā)展VM理論；這對豐富腫瘤血管生成理論的研究具有重要意義，同時對臨床抗腫瘤治療提供了靶點。

3、r>　　方法：
　　1)首先對前期實驗中收集的來自天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院71例經(jīng)手術(shù)切除且隨訪資料完整的卵巢癌臨床標(biāo)本進(jìn)行HIF-1α、EMT表征蛋白E-cadherin、vimentin及EMT調(diào)控蛋白Twistl、Snail、slug及血管內(nèi)皮相關(guān)蛋白VE-cadherin、FLT-1、FLK-1的免疫組織化學(xué)染色。重點觀察HIF-1α與E-cadherin、vimentin及VM在同一例卵巢癌標(biāo)本的連續(xù)性組織切片上的表達(dá)定

4、位之間的關(guān)系。
　　2)構(gòu)建體外三維培養(yǎng)模型，觀察是否缺氧微環(huán)境促進(jìn)了VM的形成。細(xì)胞功能學(xué)實驗方法探究缺氧與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和三維管道化形成能力之間的關(guān)系。
　　3)應(yīng)用RT-PCR、Western Blot、免疫熒光實驗從蛋白和mRNA水平檢測E-cadherin，vimentin在缺氧與常氧環(huán)境下的表達(dá)情況，探究是否缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT，從而促進(jìn)VM的形成。
　　4)Western Blot檢測VM形

5、成關(guān)鍵蛋白VE-cadherin在常氧環(huán)境和缺氧環(huán)境下表達(dá)的差異。
　　5)明膠酶譜法分析缺氧對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1)HIF-1α蛋白與血管生成擬態(tài)的形成有關(guān)71例卵巢癌中HIF-1α的陽性表達(dá)率為39.44％(28/71)。VM陽性組HIF-1α的陽性表達(dá)率為61.11％(11/18)；VM陰性組HIF-1α的陽性表達(dá)率為32.08％(17/53)。HIF-1α在VM陰

6、性組和VM陽性組陽性表達(dá)率的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。HIF-1α蛋白定位于卵巢癌細(xì)胞的胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒。HIF-1α陽性細(xì)胞簇在腫瘤浸潤邊緣、壞死區(qū)及新生血管的周圍最為密集。
　　2)體外三維培養(yǎng)證實缺氧促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成，并增強了卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　Matrigel三維培養(yǎng)模型上發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，缺氧組卵巢癌細(xì)胞形成VM的時間較早，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。OVCAR3主要形成管狀型血管生成擬態(tài)，SKOV3

7、主要形成基質(zhì)型血管生成擬態(tài)。Transwell小室體外侵襲實驗發(fā)現(xiàn)給予CoCl2缺氧處理24小時后，與常氧組相比，缺氧組穿膜細(xì)胞數(shù)增多，統(tǒng)計結(jié)果顯示差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。遷移實驗發(fā)現(xiàn)給予CoCl2缺氧處理24小時后，與常氧組相比，缺氧組遷移細(xì)胞數(shù)較多，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。缺氧處理48小時后卵巢癌SKOV3和OVCAR3細(xì)胞MMP-2活性比常氧狀態(tài)高，進(jìn)一步證明缺氧情況下卵巢癌的侵襲性增強。
　　3)缺氧誘導(dǎo)EMT發(fā)生，是血管生成擬態(tài)

8、形成的內(nèi)在機制在同一例標(biāo)本的連續(xù)性組織切片上分析VM陽性組與陰性組中HIF-1α與E-cadherin，vimentin的表達(dá)定位之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在61％(11/18)VM陽性組HIF-1α高表達(dá)時，vimentin也同時高表達(dá)，而E-cadherin低表達(dá)。而VM陰性組不存在這種對應(yīng)關(guān)系，即在VM陰性組HIF-1α高表達(dá)時，沒發(fā)現(xiàn)這種對應(yīng)關(guān)系的存在。且Twistl、slug蛋白在VM陰性組和VM陽性組陽性表達(dá)率間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，

9、VM陽性組表達(dá)較高。表明缺氧、EMT及VM三者間存在密切關(guān)系。
　　體外實驗證實SKOV3、OVCAR3細(xì)胞在CoCl2缺氧48小時細(xì)胞均出現(xiàn)明顯EMT樣形態(tài)變化，轉(zhuǎn)變成纖維母細(xì)胞樣形態(tài)，出現(xiàn)多角偽足，細(xì)胞之間的粘附性降低，細(xì)胞核呈現(xiàn)團(tuán)塊狀或固縮狀結(jié)構(gòu)。
　　細(xì)胞免疫熒光、Westernblot及RF-PCR檢測常氧環(huán)境下和缺氧環(huán)境下細(xì)胞的蛋白和mRNA表達(dá)證實缺氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3中vimentin蛋

10、白及mRNA水平均上調(diào)表達(dá)，E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實缺氧微環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞通過發(fā)，EMT樣可塑性轉(zhuǎn)變，促進(jìn)了血管生成擬態(tài)的形成。
　　4)VM形成的關(guān)鍵蛋白VE-cadherin在缺氧微環(huán)境下表達(dá)升高在人卵巢癌石蠟標(biāo)本上初步證實具有VM的卵巢癌高表達(dá)VE-cadherin蛋白，且體外Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)在缺氧微環(huán)境下，人卵巢癌細(xì)胞上調(diào)VM形成關(guān)鍵蛋白VE-cadherin的表達(dá)。
　　結(jié)