腫瘤細(xì)胞成血管塑形在血管生成擬態(tài)形成中的作用研究.pdf

1、第一部分、腫瘤細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相互作用促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表型呈現(xiàn)
　　 目的：
　　 利用體外細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)研究小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與黑色素瘤細(xì)胞的相互作用，觀察腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中的表型改變，同時(shí)觀察BMSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志分子的誘導(dǎo)作用。為進(jìn)一步了解在與腫瘤細(xì)胞接觸的微環(huán)境中BMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化的程度和特點(diǎn)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志分子的影響，為腫瘤血管生成

2、中血管內(nèi)皮細(xì)胞的來源研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1）分離C57BL小鼠股骨骨髓細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，差速貼壁純化后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析確認(rèn)BMSCs表型；
　　 2）建立Transwell非接觸式共培養(yǎng)模型，利用免疫熒光觀察共培養(yǎng)過程中BMSCs和黑色素瘤細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的表型變化，利用透射電鏡觀察誘導(dǎo)后BMSCs細(xì)胞內(nèi)是否出現(xiàn)W-P小體；定時(shí)收集共培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基，ELISA檢測培養(yǎng)基中VEGF-a水平變化，

3、Western Blot檢測細(xì)胞裂解液中VEGFR1、VEGFR2和FactorⅧ的時(shí)序性水平變化；
　　 3）利用免疫熒光染色比較非接觸式共培養(yǎng)和接觸式共培養(yǎng)細(xì)胞表型和形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1）由C57BL小鼠股骨分離獲得的細(xì)胞，經(jīng)純化培養(yǎng)后表型鑒定為CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/CD166+/CD34-/CD45-/CD133-，符合BMSCs表型；
　　 2）mBMSC

4、s與B16細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，可觀察到mBMSCs隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移逐漸呈現(xiàn)并上調(diào)血管內(nèi)皮標(biāo)志分子CD34、CD45、FactorⅧ、VEGFR-1和VEGFR-2，而原有的CD44和CD105則表達(dá)下調(diào)；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示誘導(dǎo)前FactorⅧ陽性細(xì)胞率為1.09％，誘導(dǎo)后為30.17％。超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)72h誘導(dǎo)后的mBMSCs可在透射電鏡下觀察到內(nèi)皮細(xì)胞胞漿所特有的Weibe-Palade小體出現(xiàn)。
　　 3）非接觸式共

5、培養(yǎng)條件BMSCs和B16細(xì)胞的增殖率均明顯增高，mBMSCs在共培養(yǎng)組倍增時(shí)間均值為25.02h、對(duì)照組為28.15h，B16細(xì)胞在共培養(yǎng)組倍增時(shí)間均值為26.30h、對(duì)照組為30.76h，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 4）非接觸共培養(yǎng)體系中，mBMSCs可以被B16細(xì)胞誘導(dǎo)出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞表型，同樣B16細(xì)胞也被觀察到相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子VEGFR1、VEGFR2和FactorⅧ的表達(dá)上調(diào)。B16細(xì)胞和BMSCs直接混合共培養(yǎng)（接

6、觸式共培養(yǎng)）72h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群體的VEGFR1、VEGFR2和FactorⅧ的陽性細(xì)胞率顯著降低，可見到B16細(xì)胞包繞mBMSCs生長的現(xiàn)象；
　　 5）共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液VEGF-a水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長而顯著增高。
　　 小結(jié)：
　　 1）在與腫瘤細(xì)胞相互作用的微環(huán)境中，BMSCs可以被腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)變并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞；
　　 2）腫瘤細(xì)胞亦可與BMSCs相互作用，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子的上調(diào)；

7、
　　 3）BMSCs和腫瘤細(xì)胞可相互作用，彼此促進(jìn)增殖；
　　 4）培養(yǎng)基中VEGF-a水平的時(shí)序性升高與BMSCs和腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞表型密切相關(guān)。
　　 第二部分、臨床病理分析-EMT相關(guān)蛋白在人肝癌血管生成擬態(tài)中的作用
　　 目的：
　　 本部分研究通過對(duì)97例隨訪資料完全的人類肝細(xì)胞肝癌臨床標(biāo)本進(jìn)行分析，觀察血管生成擬態(tài)（VM）的存在與否及其與臨床預(yù)后的關(guān)系；初步分析上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（

8、EMT）相關(guān)蛋白（表征蛋白E-cadherin、VE-cadherin和調(diào)控蛋白Twist1、Twist2、Snail和Slug）和VM相關(guān)蛋白（CD31/PAS、MMPs）之間的關(guān)系，及其對(duì)臨床預(yù)后的影響，篩選與VM關(guān)系密切的EMT相關(guān)蛋白，為腫瘤細(xì)胞向血管內(nèi)皮方向塑形研究提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院和附屬腫瘤醫(yī)院2001.2-2005.12年經(jīng)手術(shù)切除標(biāo)本隨訪資料完整并經(jīng)病理醫(yī)師診斷為肝細(xì)胞

9、肝癌的病例97例，對(duì)臨床病歷資料和隨訪資料進(jìn)行分析；利用HE染色和CD31/PAS雙染法觀察97例HCC組織中是否存在VM，并計(jì)數(shù)PAS/VM數(shù)量；以免疫組織化學(xué)方法檢測EMT相關(guān)蛋白和VM相關(guān)蛋白，分析二者之間的相關(guān)性及其與VM、臨床預(yù)后之間的關(guān)系，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 小結(jié)：
　　 1）VM結(jié)構(gòu)主要存在于分化差、惡性度高的實(shí)體型及低分化型HCC中，提示VM與HCC惡性生物學(xué)行為相關(guān)；
　　 2）EMT調(diào)控蛋

10、白Twist1核表達(dá)與VM關(guān)聯(lián)性最為密切，影響病人生存預(yù)后；
　　 3）Twist1與VE-cadherin、MMP9表達(dá)具有相關(guān)性，推測腫瘤細(xì)胞可能通過Twist1的調(diào)節(jié)表達(dá)VE-cadherin，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袃?nèi)皮細(xì)胞特征的腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞（TAEs），進(jìn)而形成VM；
　　 4）EMT調(diào)控蛋白Twist2、Snail和Slug與VM形成無明確關(guān)聯(lián)性。
　　 第三部分、Twist1增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和成血管塑形

11、能力
　　 目的：
　　 利用HCC細(xì)胞系對(duì)Twist1與細(xì)胞遷移、侵襲和成血管塑形能力的影響進(jìn)行體外研究，以進(jìn)一步證明Twist1和腫瘤細(xì)胞塑形、VM的關(guān)系，分析Twist1對(duì)VE-cadherin表達(dá)的調(diào)控作用和對(duì)MMPs活性的調(diào)節(jié)。從分子層面研究腫瘤細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞方向塑形的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 篩選HCC細(xì)胞系，構(gòu)建Twist1表達(dá)質(zhì)粒和shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得Twist1上調(diào)和下調(diào)模

12、型，Western Blot和RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效果；利用細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Twist1對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，進(jìn)一步利用Matrigel三維培養(yǎng)模型分析Twist1對(duì)細(xì)胞管道化塑形能力的影響；利用染色質(zhì)免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因檢測分析Twist1對(duì)VE-cadherin轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，利用明膠酶譜法分析Twist1對(duì)MMP2和MMP9活性的影響。
　　 小結(jié)：
　　 1）Twis

13、t1表達(dá)可促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲作用；
　　 2）Twist1表達(dá)可通過上調(diào)VE-cadherin促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在三維基質(zhì)中出現(xiàn)管道化塑形；
　　 3）在三維培養(yǎng)條件下，Twist1方可與VE-cadherin的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并促進(jìn)VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄；
　　 4）Twist1表達(dá)可促進(jìn)HCC細(xì)胞MMP2與MMP9的活性增強(qiáng)；
　　 5）Twist1蛋白是腫瘤細(xì)胞經(jīng)EMT、形成VM的重要調(diào)節(jié)分子

14、。
　　 第四部分、抗凋亡蛋白Bcl-2與EMT調(diào)控蛋白Twist1相互作用
　　 目的：
　　 課題組前期工作已觀察到缺氧與VM形成密切相關(guān)，缺氧可使腫瘤細(xì)胞形成“線形程序性壞死”（LPPCN），進(jìn)而引流血液形成VM，而LPPCN形成又與抗凋亡蛋白Bcl-2家族密切相關(guān)。為研究啟動(dòng)Twist1表達(dá)和使之行使功能的上游機(jī)制，探討其是否與抗凋亡蛋白有關(guān)，本部分研究將模擬缺氧微環(huán)境以評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2和

15、Twist1的時(shí)相表達(dá)。利用酵母雙雜交、真核過表達(dá)Twist1免疫共沉淀和內(nèi)源蛋白免疫共沉淀方法分析Twist1與抗凋亡蛋白Bcl-2的直接相互作用，以期進(jìn)一步明確缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞經(jīng)EMT機(jī)制向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向塑形最終形成VM的分子機(jī)制，豐富血管生成理論。
　　 方法：
　　 利用缺氧袋法制造腫瘤細(xì)胞缺氧微環(huán)境，以B16細(xì)胞系為模型研究缺氧條件下抗凋亡蛋白Bcl-2和Twist1表達(dá)的時(shí)相性變化；以酵母雙雜交系統(tǒng)篩

16、選與Twist1相互作用的抗凋亡蛋白；對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2過表達(dá)Twist1后進(jìn)行免疫共沉淀，分析Twist1與Bcl-2的直接相互作用；在缺氧條件下，進(jìn)行內(nèi)源蛋白的免疫共沉淀，分析內(nèi)源Twist1與Bcl-2的直接相互作用。
　　 小結(jié)：
　　 1）缺氧可致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)Bcl-2、Twist1的響應(yīng)性表達(dá)上調(diào)，缺氧-緩解缺氧對(duì)Twist1的上調(diào)程度高于單純?nèi)毖酰?br>　　 2）酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明Twist1蛋白可以

17、與Bcl-2蛋白發(fā)生直接相互作用；
　　 3）腫瘤細(xì)胞過表達(dá)Twist1模型可觀察到Twist1蛋白與Bcl-2蛋白發(fā)生相互作用；缺氧條件下可檢測到腫瘤細(xì)胞內(nèi)源Twist1蛋白和Bcl-2蛋白發(fā)生相互作用。
　　 4）缺氧及抗凋亡機(jī)制可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，抗凋亡蛋白Bcl-2上調(diào)可能是EMT的啟動(dòng)因素之一。
　　 結(jié)論：
　　 本文通過對(duì)BMSCs和腫瘤細(xì)胞相互作用向內(nèi)皮細(xì)胞分化、EMT相關(guān)蛋白和V

18、M的關(guān)系、以及缺氧抗凋亡機(jī)制與TAEs形成的關(guān)系等多個(gè)角度，證明腫瘤細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向轉(zhuǎn)變的“LPPCN-EMT-TAEs，LET”理論和TAEs存在的可能及分子機(jī)制。其中包括所涉及的Bcl-2與Twist1相互作用、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物呈現(xiàn)的時(shí)序關(guān)系以及相應(yīng)的組織、細(xì)胞在分子和功能學(xué)多角度的評(píng)價(jià)?！癓ET”理論可以更好的解釋腫瘤細(xì)胞在特定微環(huán)境下的生物學(xué)行為，進(jìn)一步完善腫瘤血管生成理論和EMT理論。同時(shí)，其還為腫瘤細(xì)胞分化的基礎(chǔ)