星形細胞瘤血管生成擬態(tài)的形態(tài)觀察及恩度抑制腫瘤與腫瘤血管形成相關分子機制的實驗研究.pdf

1、惡性腫瘤的生長、侵襲和轉移需要充分的血液供應。新生血管生成(neovascularization)主要包括血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)兩種方式,它們均依賴于內(nèi)皮細胞。前者指中胚層來源的血管母細胞(hemangioblast)原位分化成內(nèi)皮細胞,并生長形成循環(huán)血管;后者則指在已有的血管網(wǎng)基礎上,內(nèi)皮細胞通過分裂、芽生、擴展、延伸等機制形成新的血管網(wǎng)。血管發(fā)生和血管新生都參與了腫瘤新生血管生

2、成過程,因而針對內(nèi)皮細胞的抗血管治療成為臨床治療許多惡性腫瘤的一個重要策略,并取得了良好效果。然而總是存在一些耐藥病例,表明惡性腫瘤中可能存在不依賴內(nèi)皮細胞的血管生成方式。
　　 1999年,美國Iowas大學Maniotis等根據(jù)對人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究,發(fā)現(xiàn)了一種與經(jīng)典的腫瘤血管生成途徑完全不同、不依賴內(nèi)皮細胞的全新腫瘤血管模式,稱之為“血管生成擬態(tài)(ivasculogenic mimicry,VM)”。腫瘤生長過程

3、中,某些惡性細胞可表達多潛能未分化的胚胎樣細胞表型,通過模擬內(nèi)皮細胞并與細胞外基質相互作用形成運輸血液的管道系統(tǒng),從而與宿主血管相連使腫瘤獲得血液供應,這種模擬胚胎期血管形成的過程稱為“血管生成擬態(tài)”。VM有以下特征:(1)血管壁主要由腫瘤細胞而非內(nèi)皮細胞構成,有一層基底膜樣物;(2)內(nèi)皮特異標記的免疫組化染色(FⅧRag、CD31、CD34、KDR等)呈陰性反應,有PAS染色陽性物質;(3)紅細胞漏出和微血栓形成的情況少見,血管周圍很

4、少見到腫瘤中心性壞死現(xiàn)象;(4)僅存在于高侵襲性腫瘤,而非低侵襲性腫瘤或良性腫瘤。
　　 血管生成擬態(tài)現(xiàn)象對腫瘤生物學行為具有十分重要的意義。一方面,經(jīng)血管生成擬態(tài)方式形成的血管沒有內(nèi)皮細胞的屏障作用,從理論上講可以為腫瘤的生長提供良好的灌注;另一方面,血管生成擬態(tài)的發(fā)生需要破壞組織形成管道,加之缺乏內(nèi)皮細胞的屏障作用,管壁外襯的腫瘤細胞在釋放蛋白水解酶并溶解基底膜后有直接進入血流的可能,因此更有利于腫瘤的侵襲和轉移。VM是對傳

5、統(tǒng)血管生成理論的重要補充,不僅解釋了血管生成理論難以說明的一些問題,而且為-抑制腫瘤血液供應提供了新的思路和方法。隨后的研究發(fā)現(xiàn),血管生成擬態(tài)不僅存在于眼葡萄膜黑色素瘤中,而且同樣存在于皮膚黑色素瘤、卵巢癌、炎性乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中;VM不僅與腫瘤的生長、侵襲轉移等生物學行為有關,而且和疾病的治療預后密切相關。
　　 星形細胞瘤(astrocytoma)是成人腦組織最常見的原發(fā)惡性腫瘤,是人體血管化程度最高的腫

6、瘤之一,有明顯的血管增殖和生成特性,微血管增殖是星形細胞瘤分級的重要標準。膠質母細胞瘤(glioblastoma)是星形細胞瘤的最高級別(WHOⅣ),是已知血管化程度最高的非血管源性惡性腫瘤。針對內(nèi)皮細胞的抗血管藥物治療已經(jīng)在約50％的星形細胞瘤患者取得效果,但是臨床耐藥病例卻逐漸增多。為了更有效的進行臨床治療,深入研究星形細胞瘤血管生成的分子機制是十分必要的。以往研究已經(jīng)證實,血管發(fā)生和血管新生都參與了星形細胞瘤血管生成,但血管生成擬

7、態(tài)是否參與了星形細胞瘤的血管生成,其與星形細胞瘤的治療預后的關系如何,迄今為止還沒有系統(tǒng)的研究。
　　 1997年Folkman教授在血管內(nèi)皮瘤細胞系的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了一種抗血管新生內(nèi)源性糖蛋白,稱之為內(nèi)皮抑素(endostatin)。內(nèi)皮抑素具有強烈的抗血管新生和抗腫瘤作用,很快被應用于臨床治療惡性治腫瘤。然而由于生產(chǎn)提純非常困難,內(nèi)皮抑素的臨床應用受到限制。恩度(Endostar)是一種重組人內(nèi)皮抑素,由中華人民共和國食品

8、藥品監(jiān)督局2005年批準用于臨床治療非小細胞肺癌,我國學者在血管內(nèi)皮抑素的結構上增加了9個氨基酸,成功解決了重組人內(nèi)皮抑素穩(wěn)定性差的問題。臨床應用及相關研究已經(jīng)證實恩度具有很強的抗血管新生和抗腫瘤作用,但恩度是否對血管生成擬態(tài)有抑制作用未見報道。
　　 目的：
　　 本實驗中我們首先用人組織切片雙重染色觀察星形細胞瘤是否存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象并分析其臨床意義;其次,我們在Matrigel上三維培養(yǎng)星形細胞瘤細胞系U251、

9、SHG44,體外觀察星形細胞瘤細胞形成VM的能力;最后,研究恩度在體外對星形細胞瘤細胞的增殖、侵襲及VM的抑制作用,并利用Real time RT-PCR和Western blot技術探討相關的分子機制。
　　 實驗方法：
　　 一、臨床病理標本收集
　　 收集中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科1998-2006年診斷的星形細胞瘤病例,選擇臨床資料完整的石蠟標本共80例。其中彌漫型星形細胞瘤(WHOⅡ)30例,間變型

10、星形細胞瘤(WHOⅢ)20例,膠質母細胞瘤(WHOⅣ)30例。
　　 二、免疫組化和PAS雙重染色
　　 為了更直觀的觀察VM結構,本實驗設計了CD34與PAS、GFAP與PAS兩種雙重染色方案。首先按照間接法進行CD34或GFAP免疫組化染色,當DAB顯色后,進行PAS染色,再蘇木素復染,封片。
　　 三、組織切片形態(tài)觀察及VM的確定
　　 光學顯微鏡下觀察雙重染色的組織切片。PAS陽性CD34陰性內(nèi)有

11、紅細胞的管腔認定為VM血管,每張石蠟切片5個隨機視野(100x)有超過30％的VM血管定義為該患者存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。
　　 四、細胞培養(yǎng)
　　 共4種細胞,星形細胞瘤細胞系U251、SHG44傳代培養(yǎng),人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、大鼠腦星形膠質細胞(astrocyte)原代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,在3

12、7℃、5％CO2、飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞貼壁生長。
　　 五、細胞三維培養(yǎng)
　　 Matrigel膠4℃過夜解凍,冰上操作,吸取Matrigel膠至96孔培養(yǎng)板,50μl/孔,注意勿產(chǎn)生氣泡,置37℃培養(yǎng)箱中孵育1h,使其凝固。對數(shù)生長期的上述4種細胞,取細胞懸液100μl加入已鋪膠的96孔細胞培養(yǎng)板,細胞數(shù)為1×104個/孔,培養(yǎng)24h、48h,在倒置相差顯微鏡下(100x)對細胞小管形成情況進行圖像觀

13、察及采集。
　　 六、MTT測定細胞增殖情況
　　 對數(shù)生長期的星形細胞瘤細胞系U251、SHG44,取細胞懸液100μl加入96孔細胞培養(yǎng)板,每孔約含1×104個細胞,分別用不同濃度的恩度(0,125,250,500,and1000μg/ml)作用12h、24h、36h,MTT法測定細胞的增殖情況。
　　 七、Transwell測定細胞侵襲能力
　　 將用Matrigel包被好的Transwell小室放

14、入24孔板中,下室加入含20％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液250μl,加入已稀釋的濃度為2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml的恩度工作液250μl,使下室培養(yǎng)體系恩度終濃度分別為1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml:取細胞懸液50μl加入上室,細胞數(shù)為1×105個/孔,在上室加入恩度至終濃度為1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml,濃度與下室藥物濃度相對應,培養(yǎng)24h。用棉簽擦去微孔膜

15、上層的Matrigel膠及細胞;甲醇室溫下固定15min,蘇木素染液染色40 min,蒸餾水沖洗。在倒置相差顯微鏡下(200x)對遷移至微孔膜下層的細胞計數(shù)。
　　 八、恩度對U251體外形成VM的作用
　　 在上述(七)相同的培養(yǎng)條件下,加入已稀釋的濃度為2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml的恩度工作液100μl,使恩度終濃度分別為1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml,同時設置對照

16、孔,即只接種細胞,不加入恩度藥物,每個樣本重復3次。置37℃、5％CO2、飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在倒置相差顯微鏡下(100x)對細胞小管形成情況進行圖像觀察及采集。
　　 九、Real time RT-PCR檢測細胞VE-Cadherin和EphA2 mRNA的表達
　　 收集待測細胞,進行RNA抽提并測定OD260/OD280,反轉錄后按下列條件在熒光定量PCR儀上擴增:95℃,90sec,1個循環(huán)

17、:95℃,5sec、58℃,30sec和72℃,4min,45個循環(huán)。最后計算mRNA的相對表達量。每個樣本設3個復孔。
　　 十、Western blot檢測細胞VE-Cadherin和EphA2蛋白的表達
　　 收集待測細胞,各組細胞進行蛋白質提取后,-70℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲茲饪s膠及分離膠,上樣后120V電泳1-2h,NC轉膜2-2.5h,5％脫脂奶粉封閉1h,加一抗(1:500),4℃過夜,二抗(1:1000)室溫孵

18、育1h,ECL發(fā)光,測定灰度值。
　　 實驗結果：
　　 一、星形細胞瘤組織中VM形態(tài)
　　 雙重染色的星形細胞瘤組織切片內(nèi)可見,大部分瘤組織內(nèi)的血管為經(jīng)典的機體血管,由CD34染色陽性的內(nèi)皮細胞和PAS染成櫻桃紅色的基底膜構成。部分切片內(nèi)可見由CD34染色陰性的細胞和基底膜組成的管腔樣結構,其內(nèi)有紅細胞,此即為擬態(tài)血管。按照方法三標準,由3名病理診斷醫(yī)師獨立閱片,共發(fā)現(xiàn)8例患者存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象,其中7例為膠

19、質母細胞瘤,1例為間變型星形細胞瘤患者。
　　 二、VM和臨床資料間的關系
　　 VM在星形細胞瘤中的發(fā)生率分別為,彌漫型星形細胞瘤0(0/30),間變型星形細胞瘤5％(1/20),膠質母細胞瘤27％(7/30)。7例有VM膠質母細胞瘤患者的中位生存期是8.6個月,而沒有VM的23例患者的中位生存期是13.4個月;19例沒有VM間變型星形細胞瘤患者的中位生存期是32.7個月,1例有VM間變型星形細胞瘤患者在手術后14個月

20、死亡。
　　 三、細胞三維培養(yǎng)的形態(tài)觀察
　　 當在Matrigel上培養(yǎng)48 h后,人臍靜脈內(nèi)皮細胞形成管狀、網(wǎng)絡狀等典型的血管腔樣結構,高度惡性的膠質母細胞瘤細胞系U251也能夠形成相似的血管腔樣結構;而正常的大鼠腦膠質細胞和低度惡性的星形細胞瘤細胞系SHG44則在相同培養(yǎng)條件下不能形成血管腔樣結構。
　　 四、恩度對星形細胞瘤細胞增殖的抑制作用
　　 隨著藥物濃度增加,恩度對U251細胞和SHG44

21、細胞增殖抑制作用有所提高;同時,隨著加藥處理時間延長,抑制率也存在升高的趨勢。藥物濃度為250、500、1000μl/ml作用時間為24 h時,對U251細胞的增殖抑制率分別為15.42％、23.75％和32.32％,對SHG44細胞的增殖抑制率為14.63％、18.10％、28.19％。
　　 五、恩度對星形細胞瘤細胞侵襲的抑制作用
　　 當作用24 h時,隨著藥物濃度的增加,細胞侵襲數(shù)量明顯減少,細胞侵襲能力下降。在

22、藥物濃度為250、500、1000μg/ml時,對U251細胞的侵襲抑制率分別為57.51％、83.74％和88.53％,對SHG44細胞的侵襲抑制率為43.26％、70.84％和80.09％,同時細胞出現(xiàn)變圓、狀態(tài)變差情況。
　　 六、恩度對U251體外形成VM的作用
　　 經(jīng)恩度作用48h后,隨著藥物濃度的增加,人臍靜脈內(nèi)皮細胞在Matrigel上形成的血管腔樣結構逐漸減少,當濃度為1000μg/ml時,不能再形成管

23、腔結構。而U251細胞經(jīng)恩度加藥處理后,網(wǎng)狀連接稍有破壞,但管狀結構依然存在,各濃度沒有顯著差異。
　　 七、細胞VE-Cadherin和EphA2 mRNA及蛋白的表達
　　 Real time RT-PCR檢測細胞VE-Cadherin和EphA2的mRNA表達量和Westernblot檢測細胞蛋白表達量結果相似。VE-Cadherin在U251和HUVECs中高表達,在SHG44和正常膠質細胞中幾乎不表達;EphA

24、2在星形細胞瘤細胞系U251和SHG44中高表達,在HUVECs和正常膠質細胞中低表達。
　　 八、恩度對細胞VE-Cadherin和EphA2表達的抑制作用
　　 恩度作用24后,隨著藥物濃度的增加,星形細胞瘤細胞系U251和SHG44中EphA2的表達量逐漸降低;HUVECs中VE-Cadherin的表達量也隨著藥物濃度的增加而降低,但恩度對U251細胞VE-Cadherin的表達沒有明顯抑制作用。
　　 結

25、論：
　　 1、人星形細胞瘤組織中存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。
　　 2、人腫瘤組織和體外培養(yǎng)均提示,血管生成擬態(tài)與腫瘤分化有關,分化越低,越可能存在VM。
　　 3、血管生成擬態(tài)的出現(xiàn)預示星形細胞瘤預后不良。
　　 4、恩度在體外有效抑制星形細胞瘤細胞系U251、SHG44的增殖和侵襲,可能是通過下調細胞EphA2的表達實現(xiàn)的。
　　 5、恩度在體外顯著抑制內(nèi)皮細胞形成的血管樣結構,但不能有效抑制星形