黑色素瘤血管生成擬態(tài)形成相關(guān)機制及臨床意義與實驗研究.pdf

1、研究目的： 1)人體大樣本的回顧性研究在人體除葡萄膜黑色素瘤以外其他部位黑色素瘤組織中是否存在VM和LPPCN，并闡述VM和LPPCN的臨床病理意義，在此基礎(chǔ)上初步探索MMPs在黑色素瘤VM形成過程中的作用以及LPPCN形成相關(guān)分子機制，分析LPPCN形成相關(guān)分子生物學通路和蛋白調(diào)控，明確凋亡相關(guān)蛋白在LPPCN細胞中的表達以及缺氧、IFP和凋亡抑制劑對腫瘤細胞內(nèi)EndoG和Dnase1表達的影響。 2)觀察B16動物移

2、植瘤組織中VM、MV和內(nèi)皮依賴性血管三種腫瘤血液供應模式隨腫瘤體積的不斷增大彼此之間的時間依賴關(guān)系和空間分布特點。 3)觀察缺血缺氧以及IFP對黑色素瘤侵襲能力和不同微循環(huán)模式形成的影響，闡述其相關(guān)分子機制，初步解釋腫瘤侵襲能力的改變和Ⅷ形成與腫瘤SFP后復發(fā)和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。 4)針對VM形成相關(guān)靶點，利用動物實驗探索以VM為靶的干預措施，為臨床治療存在VM的高度惡性腫瘤提供實驗依據(jù)。 研究方法： 1)

3、收集天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1984年1月5日～2006年12月20日符合實驗條件黑色素瘤標本124例，收集患者發(fā)病年齡、性別、生存預后資料、轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和發(fā)病部位等資料，分析VM和LPPCN在腫瘤組織中的分布和臨床病理意義。建立B16黑色素瘤動物移植瘤模型，利用活性炭示蹤技術(shù)明確VM是否與機體內(nèi)皮依賴性血管相通，同時利用免疫組化和/或組織化學雙重染色和電鏡等技術(shù)觀察動物移植瘤組織中VM和LPPCN結(jié)構(gòu)、分布及彼此之間的關(guān)系。

4、 2)在動物實驗基礎(chǔ)上，利用免疫組化技術(shù)觀察基質(zhì)金屬蛋白酶類物質(zhì)MMP-2和MMP-9在有VM和無VM腫瘤組織中的表達差別，同時利用免疫組化和TUNEL染色技術(shù)篩選LPPCN細胞中表達的凋亡相關(guān)蛋白。此外，在細胞培養(yǎng)和動物黑色素移植瘤模型基礎(chǔ)上，利用Real-timePCR觀察缺氧、IFP和凋亡抑制劑對B16細胞兩種核酸內(nèi)切酶EndoG和DnaselmRNA表達影響。 3)建立B16黑色素瘤動物模型，連續(xù)處死動物。利用MVD計數(shù)

5、、免疫組化雙重染色、電鏡等觀察隨腫瘤體積的增大，VM、MV和內(nèi)皮依賴性血管時間依賴關(guān)系及空間分布。 4)建立C57小鼠B16黑色素瘤動物移植瘤模型，制作小鼠后肢缺血模型，觀察腫瘤細胞在缺血缺氧環(huán)境中的生長速度，VM的數(shù)量和分布規(guī)律，檢測MMPs等腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達；此外在小鼠腹腔和后肢肌肉同時接種B16黑色素，建立移植瘤模型，從mRNA和蛋白水平分析不同微環(huán)境對黑色素瘤VM形成和腫瘤侵襲能力的影響。 5)基于VM的

6、獨特結(jié)構(gòu)以及VM形成過程中的相關(guān)蛋白靶點，建立B16黑色素瘤動物移植瘤模型，利用免疫組化染色、明膠酶譜法和電鏡等技術(shù)研究內(nèi)皮抑素和多西環(huán)素對黑色素瘤生長、基質(zhì)金屬蛋白酶表達及活性和不同微循環(huán)模式形成的影響。 結(jié)果： 1)除葡萄膜黑色素瘤組織外，人體發(fā)生其他部位的惡性黑色素瘤組織中也存在VM，構(gòu)成VM中的PAS陽性界膜既可連續(xù)排列，也可為斷續(xù)性的，腫瘤細胞分泌PAS陽性物質(zhì)參與VM形成過程中的基質(zhì)重塑。動物實驗研究結(jié)果顯示

7、B16動物黑色素移植瘤組織中也存在Ⅷ，活性炭示蹤實驗顯示VM為腫瘤的功能性微循環(huán)。人和動物黑色素瘤組織中均可見VM、MV和內(nèi)皮依賴性血管同時存在于腫瘤組織中。統(tǒng)計結(jié)果顯示44.55％(54/124)患者的瘤組織中存在VM，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示具有VM患者的預后較沒有VM的患者差(P≤0.05)。 2)黑色素瘤組織中存在LPPCN，HMB45免疫組化染色結(jié)果顯示這些LPPCN細胞是黑色素瘤細胞。B16動物移植瘤

8、實驗結(jié)果顯示LPPCN多出現(xiàn)于腫瘤生長的早期，位于實體腫瘤的中央。統(tǒng)計結(jié)果顯示大約40％的人惡性黑色素瘤組織中存在LPPCN，生存分析結(jié)果顯示具有LPPCN患者的生存預后較無LPPCN的患者差(P≤0.05)。 3)腫瘤細胞可分泌IV型膠原參與VM形成過程中的基質(zhì)重塑。腫瘤細胞和部分間質(zhì)細胞均可表達MMP-2、MMP-9，MMP-2、MMP-9在有VM腫瘤組織中的陽性細胞率分別為65.63±7.55和63.25±7.86在無VM

9、的黑色素瘤細胞中的陽性細胞率分別為48.40±5.49和49.79±6.38，兩者的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 4)LPPCN免疫組化染色表現(xiàn)為caspase-8、caspase-6、caspase-7TNFα、TRAIL、FAS、和FASL呈陰性，而caspase-9、caspase-3和Bax染色為陽性。TUNEL染色后陽性的腫瘤細胞隨機散在分布。Realtime-PCR結(jié)果顯示隨培養(yǎng)時間延長缺氧組和對照組B16

10、細胞的DnaselmRNA表達量均增高(P<0.05)，缺氧組內(nèi)EndoGmRNA隨培養(yǎng)時間延長表達水平呈上升趨勢，在6h和8h顯著高于對照組(P<0.05)，24h后缺氧組與對照組EndoGmRNA表達量無差別(P>0.05)，同一組中EndoGmRNA表達量明顯高于DnaselmRNA；腹腔組與后肢組黑色素瘤組織內(nèi)EndoG和DnaselmRNA表達水平無明顯差異(P>0.05)；動物缺氧模型腫瘤組織EndoGmRNA表達量顯著高于

11、對照組(P<0.05)，DnaselmRNA在對照組黑色素瘤內(nèi)表達增高(P>0.05)。缺血組和對照組的黑色素瘤組織EndoGmRNA的表達水平均顯著高于Dnasel(P<0.05)，其結(jié)果與體外細胞培養(yǎng)一致；Caspase抑制劑組和對照組EndoG(P>0.05)和DnaselmRNA(P>0.05)表達幾乎沒有差別。 5)VM、MV和內(nèi)皮依賴性血管可共同存在于腫瘤組織中；動物實驗研究結(jié)果顯示在黑色素移植瘤形成早期，腫瘤組織內(nèi)

12、血液供應方式以VM為主，隨著時間的推移，MV和內(nèi)皮依賴性血管數(shù)目呈現(xiàn)增加趨勢。內(nèi)皮依賴性血管的數(shù)目與腫瘤體積的大小呈高度正相關(guān)(r=0.718，P=0.009)，VM計數(shù)與腫瘤體積的大小成高度負相關(guān)(r=-0.77，P=0.003)。 6)腫瘤生長早期，缺血組腫瘤生長速度較未缺血組慢(t=0.858，P≤0.05)，但到第15天處死荷瘤鼠時兩組腫瘤平均體積差異已無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單樣本t檢驗統(tǒng)計結(jié)果表明缺血組瘤組

13、織內(nèi)的vM多于對照組。缺血組黑色素組織HIF-1α陽性率為68.78％，對照組為45.62％，其差別具有顯著性(P≤0.05)，MMP-2和MMP-9在缺血組的表達率高于對照組(均P<0.05)。VEGF在缺血組內(nèi)呈高表達(P≤0.05)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明僅缺血組內(nèi)黑色素瘤細胞HIF-1α的表達水平與該組腫瘤體積(r=0.472，P=0.015)和VM數(shù)目呈正相關(guān)(r=0.391，P=0.050)。 7)腹腔組腫瘤

14、組織中VM明顯少于后肢肌肉瘤組織內(nèi)的VM，其差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；后肢組腫瘤細胞CK-18和HIF-1α表達均明顯高于腹腔組(均P<0.05)，后肢組腫瘤細胞表達MMP-2和MM-9蛋白和mRNA表達水平均明顯高于腹腔組(P<0.05)。 8)多西環(huán)素組(D組)與對照組(C組)，多西環(huán)素+內(nèi)皮抑素聯(lián)合組(DE組)與C組的小鼠腫瘤平均體積間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各干預組的MV和VM計數(shù)均分別與C組比較有統(tǒng)

15、計學差異(P<0.05)；MMP-9、MMP-2表達的陽性率從高到低均依次為對照組(C)組、內(nèi)皮抑素組(E)組、多西環(huán)素和內(nèi)皮抑素組(DE)組、多西環(huán)素組(D)組，且差別均有統(tǒng)計學意義(F=12.791，F(xiàn)=5.560，P<0.05)；TIMP-2從高到低依次是D組、DE、E組及C組，其差異也均有統(tǒng)計學意義(F=4.638，P<0.05)；明膠酶譜法染色結(jié)果顯示D組和DE組MMP-9和活性MMP-2條帶酶解量灰度值明顯低于C組。電鏡觀察

16、結(jié)果顯示內(nèi)皮抑素組瘤組織中內(nèi)皮依賴性血管中的內(nèi)皮細胞較為幼稚。 結(jié)論： 1)人和動物的黑色素瘤組織均可見到VM的存在。因為VM特殊的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點，具有VM的腫瘤組織血道轉(zhuǎn)移率較高，臨床療效不佳，腫瘤患者生存預后差。VM形成具有較為獨特的分子調(diào)控機制，腫瘤細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶類物質(zhì)和一些細胞外基質(zhì)參與VM形成過程中的基質(zhì)重塑。 2)在凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控下，部分腫瘤細胞可形成LPPCN，LPPCN的形成是VM和內(nèi)皮

17、依賴性血管形成的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，具有LPPCN的腫瘤患者臨床預后較無LPPCN的腫瘤患者差。核酸內(nèi)切酶EndoG和Dnase1可能與黑色素瘤LPPCN形成具有一定關(guān)系，這兩種酶的表達與腫瘤細胞局部缺氧微環(huán)境有密切聯(lián)系。 3)在黑色素瘤生長的不同階段，存在血液供應“三階段”現(xiàn)象。 4)腫瘤局部缺氧微環(huán)境和IFP對VM形成和腫瘤細胞侵襲能力有重要影響。在缺氧環(huán)境下，黑色素瘤細胞高表達HIF-1α，HIF-1α可上調(diào)MMP-2和