黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE-A家族在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、惡性腫瘤是我國(guó)主要的公共健康問(wèn)題，其中喉癌（laryngeal carcinoma, LC）是我國(guó)最常見的頭頸部惡性腫瘤，而喉癌以其日益增高的發(fā)病率，也逐漸引起廣泛關(guān)注。喉癌的治療包括手術(shù)治療，放療和化療。然而，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移比較常見，且預(yù)后仍不理想。因此需要迫切尋求一種新的方法治療喉癌患者。黑色素瘤相關(guān)抗原（Melanoma antigen，MAGE）-A屬于癌睪丸抗原（Cancer/testis antigens，CTA），高表達(dá)于多種

2、腫瘤組織，而在除干細(xì)胞外的正常人體組織中均不表達(dá)。
　　本課題組一直致力于MAGE-A家族在腫瘤中表達(dá)及意義的研究。而MAGE-A家族在喉鱗狀細(xì)胞癌病人的表達(dá)模式仍不明。本研究利用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、MAGE-A9和MAGE-A11在喉鱗狀細(xì)胞癌組織、相應(yīng)正常黏膜組織中的表達(dá)及與其臨床生物學(xué)指標(biāo)和預(yù)后之間的關(guān)系。我們進(jìn)一步通過(guò)甲基化特異性P

3、CR（Methylation specific polymerase chain reaction， MSP）的方法檢測(cè)了106例 LSCC組織及22例相應(yīng)的癌旁正常組織中MAGE-A1和 MAGE-A3的甲基化水平，采用免疫組化法對(duì)這些組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。并通過(guò)多重巢式 RT-PCR（Multiple nested RT-PCR）檢測(cè) MAGE-A基因在喉鱗狀細(xì)胞癌外周血中

4、的 mRNA水平，從而為MAGE-A家族成為喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后監(jiān)測(cè)的特異性指標(biāo)提供理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分 MAGE-A家族在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義
　　目的：
　　探討黑色素瘤相關(guān)抗原 MAGE-As、-A9和-A11在喉鱗狀細(xì)胞癌組織，相應(yīng)正常組織中的表達(dá)及與其臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系，特別是預(yù)后意義。
　　方法：
　　1應(yīng)用免疫組織化學(xué)法在睪丸組織中驗(yàn)證 MAGE

5、-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、-A9和-A11的特異性。
　　2應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)106例LSCC組織中MAGE-As、-A9和-A11蛋白的表達(dá)，分別用卡方檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存分析以及Cox回歸分析檢測(cè)蛋白表達(dá)與患者臨床生物學(xué)指標(biāo)及其預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1 MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A

6、12）蛋白正常睪丸組織和LSCC中均有表達(dá)。在正常睪丸組織中尤其精原細(xì)胞和精母細(xì)胞核中均顯著表達(dá)。MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白在癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分定位于細(xì)胞核。106例正常黏膜組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白表達(dá)， LSCC組織中 MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、

7、-A6、-A10和-A12）的陽(yáng)性率為54.72％（58/106）。
　　在LSCC組織中，MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白表達(dá)與LSCC患者的年齡、性別、吸煙量、臨床分型、組織學(xué)分級(jí)均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）但與臨床分期、腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移（P＜0.05）呈正相關(guān)。
　　2 MAGE-A9蛋白正常睪丸組織和LSCC組織中均有表達(dá)。在正常睪丸組織中尤其精原細(xì)胞和精母

8、細(xì)胞核中均顯著表達(dá)。MAGE-A9蛋白在癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分定位于細(xì)胞核。106例正常粘膜組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-A9蛋白表達(dá)，LSCC組織中MAGE-A9的陽(yáng)性率為46.22%（49/106）。
　　在LSCC組織中，MAGE-A9蛋白表達(dá)與LSCC患者的年齡、性別、吸煙量、臨床分型、組織學(xué)分級(jí)均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）但與臨床分期、腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移（P＜0.05）呈正相關(guān)。
　　3 MAGE-A11蛋白正常睪丸

9、組織和LSCC組織中均有表達(dá)。在正常睪丸組織中尤其精原細(xì)胞和精母細(xì)胞核中均顯著表達(dá)。MAGE-A11蛋白在癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分定位于細(xì)胞核。106例正常黏膜組織中未發(fā)現(xiàn) MAGE-A11蛋白表達(dá)，LSCC組織中 MAGE-A11的陽(yáng)性率為51.89%（55/106）。
　　在LSCC組織中，MAGE-A11蛋白表達(dá)與臨床分期和腫瘤大?。≒＜0.05）呈正相關(guān)，MAGE-A11蛋白與LSCC患者的年齡、組織學(xué)分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移

10、均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。
　　4106例LSCC組織標(biāo)本中，MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、-A9和-A11蛋白表達(dá)呈均勻分布，三種蛋白同時(shí)表達(dá)的有35例，占33.02%（35/106）。106例LSCC中三種蛋白陽(yáng)性表達(dá)率之間無(wú)明顯差異（χ2=1.585，P＝0.453）。
　　5 LSCC患者表達(dá)MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A

11、6、-A10和-A12）, MAGE-A9, MAGE-A11陽(yáng)性的患者的總生存期比其表達(dá)陰性的患者低。多因素分析106例LSCC患者的生存率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，年齡，性別，織學(xué)分級(jí)，腫瘤分型，吸煙與生存率均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），而MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白高表達(dá)，MAGE-A9蛋白高表達(dá)，MAGE-A11蛋白高表達(dá)，臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤大小與生存率相關(guān)（P<0

12、.05）。Cox回歸模型分析表明MAGE-A9蛋白表達(dá)是LSCC患者預(yù)后差的獨(dú)立因素。
　　結(jié)論：
　　MAGE-As，-A9，-A11是 LSCC的腫瘤相關(guān)性抗原，可成為 LSCC免疫治療的理想抗原。此外，MAGE-A9可作為L(zhǎng)SCC患者預(yù)后不良的指標(biāo)。
　　第二部分 MAGE-A家族在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制
　　目的：
　　探討LSCC及相應(yīng)癌旁正常組織中MAGE-A1和MAGE-A3的甲基

13、化水平，并分析其甲基化與對(duì)應(yīng)標(biāo)本中MAGE-A家族表達(dá)水平的關(guān)系。同時(shí)探討了甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在LSCC組織中的表達(dá)，并分析了其表達(dá)與標(biāo)本中MAGE-A1和MAGE-A3甲基化狀態(tài)及其與MAGE-A家族表達(dá)的相關(guān)性。
　　方法：
　　通過(guò)MSP方法檢測(cè)了106例LSCC組織及22例相應(yīng)的癌旁正常組織中MAGE-A1和MAGE-A3的甲基化水平，采用免疫組化法對(duì)這些組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1

14、、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，MAGE-A1和MAGE-A3的甲基化采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)與MAGE-A甲基化狀態(tài)及MAGE-A表達(dá)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或 Fisher’s檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1 MAGE-A1基因在LSCC組織中的非甲基化率為39.6%（42/106）。22例癌旁正常組織

15、中MAGE-A1基因均為甲基化狀態(tài)。
　　2 MAGE-A3基因在LSCC組織中的非甲基化率為46.2%（49/106）。22例癌旁正常組織中MAGE-A3基因均為甲基化狀態(tài)。
　　3 MAGE-A1和 MAGE-A3基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化狀態(tài)與整個(gè)MAGE-A家族的蛋白表達(dá)水平有顯著正相關(guān)(r=0.388，P=0.000)(r=0.387， P=0.000)。
　　4在LSCC組織中，DNMT1、DNMT3a和DNMT

16、3b蛋白的陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核。106例LSCC組織中有37例DNMT1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為34.91%；40例DNMT3a蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為37.74%；35例DNMT3b蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為33.02%。
　　LSCC組織中 MAGE-A1的去甲基化水平與甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（χ2=13.017，r=-0.350，P=0.000）（χ2=19.755， r=-0.43

17、2， P=0.000）（χ2=11.038， r=-0.323， P=0.001）。MAGE-A3的去甲基化水平與甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（χ2=22.490，r=-0.480，P=0.000）（χ2=21.327， r=-0.449，P=0.000）（χ2=14.459，r=-0.369，P=0.000）。
　　LSCC組織中 MAGE-As的表達(dá)與 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT1、DN

18、MT3a和 DNMT3b的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（χ2=25.127，r=-0.487， P=0.000）（χ2=19.206， r=-0.426， P=0.000）（χ2=21.406， r=-0.449， P=0.000）。
　　5 Eca109細(xì)胞中MAGE-As表達(dá)陽(yáng)性，Hep-2中MAGE-As表達(dá)陰性。
　　6 RT-PCR結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理的 Hep-2細(xì)胞未見 MAGE-As mRNA的表達(dá)。應(yīng)用2.5μmo

19、l/L、5μmol/L5-aza-CdR分別作用細(xì)胞72小時(shí)后可見MAGE-As基因重新表達(dá)，隨著藥物濃度增高，MAGE-As基因表達(dá)增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT家族通過(guò)參與MAGE-A家族的甲基化過(guò)程調(diào)控MAGE-A基因的表達(dá)，在LSCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。
　　第三部分喉鱗狀細(xì)胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中MAGE-A基因的表達(dá)
　　目的：
　　探討 MAGE-A基因在

20、LSCC外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法：
　　采用多重巢式 RT-PCR（multiplex nested RT- PCR）方法檢測(cè)65例LSCC患者和30例健康人外周血中 MAGE-A基因的 mRNA表達(dá)水平，并利用酶切的方法鑒定該家族成員 MAGE-A1、-A2、-A3、-A4和-A6的表達(dá)情況。同時(shí)利用普通 RT-PCR方法檢測(cè) MAGE-A9和 MAGE-A11基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果

21、：
　　1 MAGE-A基因在LSCC患者外周血中表達(dá)率為29.23%（19/65）。應(yīng)用每一種基因所對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶 Bcl I、EcoRI、Eco47 III、Sph I和Afl III進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，觀察到MAGE-A基因在LSCC外周血中的表達(dá)順序?yàn)?A2>A3>A1>A4>A6。MAGE-A1的表達(dá)率為16.90%（11/65）， MAGE-A2的表達(dá)率21.54%(14/65)，MAGE-A3的表達(dá)率為20%(13/6

22、5)， MAGE-A4的表達(dá)率為15.38%(10/65)， MAGE-A6的表達(dá)率為13.85%(9/65)，MAGE-A9的表達(dá)率為18.46%(12/65)，MAGE-A11的表達(dá)率為23.08%(15/65)。17（17/65）個(gè) LSCC患者外周血只表達(dá)一種MAGE-A基因，11（11/65）個(gè)LSCC患者外周血表達(dá)兩種 MAGE-A基因，8（8/65）個(gè)LSCC患者外周血表達(dá)三種 MAGE-A基因，0（0/65）個(gè) LSCC

23、患者外周血同時(shí)表達(dá)四種 MAGE-A基因，5（5/65）個(gè) LSCC患者外周血同時(shí)表達(dá)五種MAGE-A基因，3（3/65）個(gè)LSCC患者外周血表達(dá)六種 MAGE-A基因，其中2（2/65）個(gè)LSCC患者外周血中同時(shí)表達(dá)七種 MAGE-A基因。
　　2 MAGE-A基因的表達(dá)與多個(gè)臨床指標(biāo)存在相關(guān)性。MAGE-A2基因的表達(dá)率隨 LSCC患者腫瘤大小的增加而增加（χ2=4.916，P=0.027）。MAGE-A9基因的表達(dá)率隨LSC

24、C患者腫瘤大小的增加而增加（χ2=7.304， P=0.007）。MAGE-A6基因的表達(dá)率隨LSCC患者組織學(xué)分級(jí)的增加而增加（χ2=4.746，P=0.029）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者 MAGE-A基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=17.868，P=0.000）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者M(jìn)AGE-A1基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=10.943，P=0.001）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者M(jìn)AG

25、E-A2基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=13.848，P=0.000）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者M(jìn)AGE-A3基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=16.250，P=0.000）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者M(jìn)AGE-A4基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=13.446，P=0.000）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 LSCC患者 MAGE-A6基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=16.565， P=0

26、.000）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 LSCC患者M(jìn)AGE-A9基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=18.092，P=0.000）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者M(jìn)AGE-A11基因的表達(dá)率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=21.262，P=0.000）。MAGE-A基因的表達(dá)率隨 LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=5.311，P=0.021），MAGE-A1基因的表達(dá)率隨LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=6.237，P=0

27、.013）， MAGE-A2基因的表達(dá)率隨LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=6.032， P=0.014），MAGE-A11基因的表達(dá)率隨 LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=10.543，P=0.001）。MAGE-A基因的表達(dá)率隨LSCC患者吸煙量增加而增加（χ2=5.831，P=0.016）。MAGE-A2基因的表達(dá)率隨LSCC患者吸煙量增加而增加（χ2=4.406，P=0.036）。MAGE-A3基因的表達(dá)率隨LSCC