鞘氨醇激酶-1(SphK1)在卵巢癌血管生成中的作用研究.pdf

1、神經(jīng)酰胺（Ceramide,Cer）、神經(jīng)鞘氨醇（Sphingosine，Sph）和鞘氨醇-1-磷酸鹽（Sphingosine-1phosphate，S1P）是三種重要的鞘磷脂代謝產(chǎn)物,參與細(xì)胞增殖與凋亡、血管生成,進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase,SphK）是細(xì)胞內(nèi)鞘磷脂代謝的關(guān)鍵激酶，能催化神經(jīng)鞘氨醇Sph生成鞘氨醇-1-磷酸鹽S1P，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的傳遞，并在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)

2、、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮重要作用。SphK是一個(gè)進(jìn)化保守的脂質(zhì)激酶家族，包含5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，在人、鼠、酵母、植物中均有表達(dá)。1998年，Olivera等首次從大鼠腎細(xì)胞中提取SphK，其相對(duì)分子質(zhì)量為49000。目前，SphK家族已克隆并鑒定出7個(gè)同工酶，其中SphK1和SphK2為人類和小鼠來(lái)源。SphK1表達(dá)于人體的多數(shù)正常細(xì)胞中，主要分布在細(xì)胞的胞質(zhì)和核周區(qū)域，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域；而其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常。SphK1經(jīng)外界的多

3、種因素刺激后，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鞘氨醇-1-磷酸鹽S1P濃度增高，以及某些類型的細(xì)胞釋放SphK1增加。
　　S1P是G蛋白偶聯(lián)受體家族（GPCR）的一個(gè)特殊配體，作為細(xì)胞膜鞘磷脂的代謝產(chǎn)物之一，S1P可介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，其同時(shí)兼具有第一信使及第二信使的雙重功能，促使細(xì)胞存活，進(jìn)而調(diào)節(jié)包括腫瘤形成、淋巴細(xì)胞應(yīng)答、免疫反應(yīng)、血管生成等不同病理、生理過(guò)程。偶聯(lián)蛋白受體的亞型及細(xì)胞組織中 G蛋白受體的特異性表達(dá)決定了S1P生物學(xué)效應(yīng)的多樣性

4、。目前，已發(fā)現(xiàn)S1P受體（sphingosine-phoshate receptor，S1PR）有S1PR1-S1PR5共5中亞型。其中，S1PR1、S1PR2、S1PR3是血管中的主要受體亞型。研究表明，S1P對(duì)于血管生成具有雙向調(diào)控作用，通過(guò)S1PR1、S1PR2、S1PR3調(diào)控下游信號(hào)通路，從而介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)以及粘附作用，促使新生血管趨于穩(wěn)定，形成完整的血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障，并且維持新生血管的功能完整及其穩(wěn)

5、定性等。目前發(fā)現(xiàn)S1P在卵巢癌患者中異常高表達(dá)，同時(shí) S1P參與了卵巢癌的多種生物行為，但S1P在卵巢癌血管生成中的作用及機(jī)制尚不明確。
　　血管生成（angiogenesis）是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，包括激活期血管基底膜降解；血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移；重建形成新的血管和血管網(wǎng)等多個(gè)步驟，是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的多種分子的復(fù)雜過(guò)程，影響腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。SphK在血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。Sp

6、hK1的產(chǎn)物S1P可以被看作是一種脂類促血管生長(zhǎng)因子，參與多種病理生理過(guò)程中的血管生成。文獻(xiàn)表明，SphK/S1P信號(hào)通路能促進(jìn)肝臟纖維化相關(guān)的血管生成。SphK/S1P通路可通過(guò)刺激乳腺癌血管生成和淋巴管生成，促進(jìn)該腫瘤的發(fā)展。此外，S1P能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌VEGF、白介素（IL）-8和IL-6等促血管生成因子，這些因子能通過(guò)旁分泌的作用進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和血管生成。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，S1P作用的MS-

7、1鼠胰島細(xì)胞其VEGF啟動(dòng)子活性增強(qiáng)。應(yīng)用SphK1抑制劑DMS阻斷SphK1/S1P信號(hào)通路，可抑制肝癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)及血管再生。因此，通過(guò)SphK1/S1P調(diào)節(jié)促血管生長(zhǎng)因子以及血管生成,可能成為腫瘤治療新方向。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是最為常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，由于臨床發(fā)現(xiàn)多是晚期而使死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位，嚴(yán)重危害女性健康。目前認(rèn)為，EOC易于轉(zhuǎn)移及廣泛播散的特點(diǎn)是造成其生存

8、率低下的主要原因之一，而腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程均依賴于腫瘤血管的生成。目前，SphK在EOC血管生成中的作用及機(jī)制尚不明確。
　　基于上述基礎(chǔ)，本課題針對(duì)SphK1在卵巢癌的表達(dá)進(jìn)行研究，探究其與血管生成的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中SphK1的表達(dá)與微血管密度呈正相關(guān)，基因沉默SphK1可以抑制卵巢癌細(xì)胞的體外促血管生成能力，并抑制該細(xì)胞S1P的分泌及促血管生成因子IL-8的表達(dá)。抑制SphK1可減少人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的

9、血管生成。
　　本課題分為三個(gè)部分：
　?。?）卵巢癌組織SphK1的表達(dá)與微血管密度的關(guān)系。
　?。?）SphK1對(duì)卵巢癌細(xì)胞促血管生成作用的影響。
　?。?）SphK1對(duì)裸鼠卵巢癌組織血管生成的作用研究。
　　第一部分卵巢癌組織SphK1的表達(dá)與微血管密度的關(guān)系
　　研究目的：
　　研究鞘氨醇激酶-1（SphK1）在卵巢癌組織中的表達(dá)水平，分析其與卵巢癌組織中微血管密度的關(guān)系，并進(jìn)一步探究其

10、與卵巢癌血管生成的相關(guān)性。
　　研究方法：
　　免疫組化法測(cè)定卵巢惡性腫瘤組織和卵巢良性腫瘤或子宮肌瘤患者卵巢組織的SphK1及CD34蛋白的表達(dá)水平及計(jì)算微血管密度（microvessel density，MVD）。采用pearson相關(guān)分析分析卵巢癌SphK1表達(dá)與MVD的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.卵巢癌組織中SphK1蛋白的表達(dá)水平較非癌卵巢組織高，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；
　　

11、2.SphK1蛋白的表達(dá)分別與FIGO分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)
　　(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，表達(dá)量相應(yīng)增加；而SphK1蛋白表達(dá)量與年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型無(wú)關(guān)；
　　3.卵巢癌組織中MVD較卵巢良性腫瘤組織高，兩者差異具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　4.卵巢癌組織MVD水平與SphK1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.567，P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　SphK1在卵巢癌組織

12、中高表達(dá)，且SphK1蛋白的表達(dá)分別與FIGO分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及病理類型無(wú)關(guān)。卵巢癌組織中MVD較卵巢良性腫瘤組織高，其水平與SphK1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。
　　第二部分SphK1對(duì)卵巢癌細(xì)胞促血管生成作用的影響
　　研究目的：
　　研究鞘氨醇激-1（SphK1）表達(dá)改變對(duì)鞘氨醇-1-磷酸鹽（S1P）在卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3）中的分泌水平的影響，探索其對(duì)卵巢癌細(xì)胞促血管生成的作用和可能

13、的機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.設(shè)計(jì)合成干擾序列基因沉默SphK1，管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因沉默SphK1后的卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞（EA.hy926細(xì)胞）血管形成的影響；
　　2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)SphK1基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞株S1P分泌水平的影響；
　　3.Realtime-PCR檢測(cè)S1P對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理24小時(shí)卵巢癌細(xì)胞株促血管生成作用的影響（白細(xì)胞介素IL-8）；<

14、br>　　4.設(shè)計(jì)合成干擾序列基因沉默S1PR1-S1PR3，Realtime-PCR檢測(cè)S1PR基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞株促血管生成作用的影響（IL-8）。
　　研究結(jié)果：
　　1.基因沉默SphK1后的卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)基使EA.hy926細(xì)胞株管腔形成明顯減少（P＜0.05)；
　　2.SphK1基因沉默可顯著降低卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)S1P分泌水平(P＜0.05)；
　　3.S1P可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3

15、 IL-8的表達(dá)(P＜0.05)；
　　4.S1PR1、S1PR3基因沉默S1PR1、S1PR3可抑制卵巢癌細(xì)胞株IL-8的表達(dá)（P＜0.05)，而S1PR2基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞株IL-8的表達(dá)影響不明顯（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　SphK1在卵巢癌的血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用?；虺聊琒phK1能夠抑制卵巢癌細(xì)胞S1P的分泌以及腫瘤血管生成，證實(shí)SphK1可通過(guò)調(diào)節(jié)S1P影響卵巢癌血管生成。S1P可能通過(guò)刺激

16、卵巢癌細(xì)胞白細(xì)胞介素IL-8的分泌從而發(fā)揮促進(jìn)血管生成效應(yīng)。S1P的生物學(xué)效應(yīng)取決于與其結(jié)合的特異性受體的亞型，S1PR1、S1PR3沉默可降低卵巢癌細(xì)胞IL-8的分泌，而基因沉默S1PR3對(duì)IL-8的分泌影響不大，表明S1P可能通過(guò)S1PR1、S1PR3兩種特異性受體調(diào)節(jié)IL-8的表達(dá)從而參與卵巢癌血管生成的雙向調(diào)控作用。
　　第三部分SphK1對(duì)裸鼠卵巢癌組織血管生成的作用研究
　　研究目的：
　　研究鞘氨醇激酶1

17、（SphK1）在裸鼠皮下瘤中的表達(dá)水平，探索SphK1及其抑制劑對(duì)裸鼠卵巢癌組織血管生成的作用。
　　研究方法：
　　建立裸鼠卵巢癌皮下成瘤模型，并設(shè)立SKI-II藥物處理組與對(duì)照組（生理鹽水組），監(jiān)測(cè)裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)情況，檢測(cè)裸鼠體重，觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組皮下成瘤情況，成瘤直徑、腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量，通過(guò)免疫組化觀察皮下瘤卵巢癌組織SphK1蛋白及CD34蛋白表達(dá)水平并計(jì)數(shù)MVD。
　　研究結(jié)果：
　　1.SKI-I