鞘氨醇激酶-1(SphK1)在卵巢癌血管生成中的作用研究.pdf

1、神經(jīng)酰胺（Ceramide,Cer）、神經(jīng)鞘氨醇（Sphingosine，Sph）和鞘氨醇-1-磷酸鹽（Sphingosine-1phosphate，S1P）是三種重要的鞘磷脂代謝產(chǎn)物,參與細胞增殖與凋亡、血管生成,進而調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase,SphK）是細胞內鞘磷脂代謝的關鍵激酶，能催化神經(jīng)鞘氨醇Sph生成鞘氨醇-1-磷酸鹽S1P，參與調節(jié)細胞內多條重要信號轉導通路的傳遞，并在維持細胞穩(wěn)態(tài)

2、、調節(jié)細胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮重要作用。SphK是一個進化保守的脂質激酶家族，包含5個保守結構域，在人、鼠、酵母、植物中均有表達。1998年，Olivera等首次從大鼠腎細胞中提取SphK，其相對分子質量為49000。目前，SphK家族已克隆并鑒定出7個同工酶，其中SphK1和SphK2為人類和小鼠來源。SphK1表達于人體的多數(shù)正常細胞中，主要分布在細胞的胞質和核周區(qū)域，沒有跨膜結構域；而其在腫瘤細胞中表達異常。SphK1經(jīng)外界的多

3、種因素刺激后，可導致細胞內鞘氨醇-1-磷酸鹽S1P濃度增高，以及某些類型的細胞釋放SphK1增加。
　　S1P是G蛋白偶聯(lián)受體家族（GPCR）的一個特殊配體，作為細胞膜鞘磷脂的代謝產(chǎn)物之一，S1P可介導多種生物學效應，其同時兼具有第一信使及第二信使的雙重功能，促使細胞存活，進而調節(jié)包括腫瘤形成、淋巴細胞應答、免疫反應、血管生成等不同病理、生理過程。偶聯(lián)蛋白受體的亞型及細胞組織中 G蛋白受體的特異性表達決定了S1P生物學效應的多樣性

4、。目前，已發(fā)現(xiàn)S1P受體（sphingosine-phoshate receptor，S1PR）有S1PR1-S1PR5共5中亞型。其中，S1PR1、S1PR2、S1PR3是血管中的主要受體亞型。研究表明，S1P對于血管生成具有雙向調控作用，通過S1PR1、S1PR2、S1PR3調控下游信號通路，從而介導血管內皮細胞和血管平滑肌細胞的遷移運動以及粘附作用，促使新生血管趨于穩(wěn)定，形成完整的血管內皮細胞屏障，并且維持新生血管的功能完整及其穩(wěn)

5、定性等。目前發(fā)現(xiàn)S1P在卵巢癌患者中異常高表達，同時 S1P參與了卵巢癌的多種生物行為，但S1P在卵巢癌血管生成中的作用及機制尚不明確。
　　血管生成（angiogenesis）是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，包括激活期血管基底膜降解；血管內皮細胞的激活、增殖、遷移；重建形成新的血管和血管網(wǎng)等多個步驟，是一個涉及多種細胞的多種分子的復雜過程，影響腫瘤的生長與轉移。SphK在血管生成過程中發(fā)揮重要的作用。Sp

6、hK1的產(chǎn)物S1P可以被看作是一種脂類促血管生長因子，參與多種病理生理過程中的血管生成。文獻表明，SphK/S1P信號通路能促進肝臟纖維化相關的血管生成。SphK/S1P通路可通過刺激乳腺癌血管生成和淋巴管生成，促進該腫瘤的發(fā)展。此外，S1P能通過促進腫瘤細胞、免疫細胞等多種細胞分泌VEGF、白介素（IL）-8和IL-6等促血管生成因子，這些因子能通過旁分泌的作用進一步促進內皮細胞的遷移、增殖和血管生成。已有實驗證實，S1P作用的MS-

7、1鼠胰島細胞其VEGF啟動子活性增強。應用SphK1抑制劑DMS阻斷SphK1/S1P信號通路，可抑制肝癌細胞VEGF的表達及血管再生。因此，通過SphK1/S1P調節(jié)促血管生長因子以及血管生成,可能成為腫瘤治療新方向。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是最為常見的婦科惡性腫瘤，由于臨床發(fā)現(xiàn)多是晚期而使死亡率居婦科惡性腫瘤首位，嚴重危害女性健康。目前認為，EOC易于轉移及廣泛播散的特點是造成其生存

8、率低下的主要原因之一，而腫瘤的生長、浸潤、轉移過程均依賴于腫瘤血管的生成。目前，SphK在EOC血管生成中的作用及機制尚不明確。
　　基于上述基礎，本課題針對SphK1在卵巢癌的表達進行研究，探究其與血管生成的相關性，實驗發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中SphK1的表達與微血管密度呈正相關，基因沉默SphK1可以抑制卵巢癌細胞的體外促血管生成能力，并抑制該細胞S1P的分泌及促血管生成因子IL-8的表達。抑制SphK1可減少人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的

9、血管生成。
　　本課題分為三個部分：
　?。?）卵巢癌組織SphK1的表達與微血管密度的關系。
　?。?）SphK1對卵巢癌細胞促血管生成作用的影響。
　?。?）SphK1對裸鼠卵巢癌組織血管生成的作用研究。
　　第一部分卵巢癌組織SphK1的表達與微血管密度的關系
　　研究目的：
　　研究鞘氨醇激酶-1（SphK1）在卵巢癌組織中的表達水平，分析其與卵巢癌組織中微血管密度的關系，并進一步探究其

10、與卵巢癌血管生成的相關性。
　　研究方法：
　　免疫組化法測定卵巢惡性腫瘤組織和卵巢良性腫瘤或子宮肌瘤患者卵巢組織的SphK1及CD34蛋白的表達水平及計算微血管密度（microvessel density，MVD）。采用pearson相關分析分析卵巢癌SphK1表達與MVD的相關性。
　　研究結果：
　　1.卵巢癌組織中SphK1蛋白的表達水平較非癌卵巢組織高，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；
　　

11、2.SphK1蛋白的表達分別與FIGO分期、遠處轉移相關
　　(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，表達量相應增加；而SphK1蛋白表達量與年齡、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及病理類型無關；
　　3.卵巢癌組織中MVD較卵巢良性腫瘤組織高，兩者差異具有有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；
　　4.卵巢癌組織MVD水平與SphK1蛋白表達呈正相關（r=0.567，P<0.05）。
　　結論：
　　SphK1在卵巢癌組織

12、中高表達，且SphK1蛋白的表達分別與FIGO分期及遠處轉移相關，而與年齡、淋巴結轉移、分化程度及病理類型無關。卵巢癌組織中MVD較卵巢良性腫瘤組織高，其水平與SphK1蛋白表達呈正相關。
　　第二部分SphK1對卵巢癌細胞促血管生成作用的影響
　　研究目的：
　　研究鞘氨醇激-1（SphK1）表達改變對鞘氨醇-1-磷酸鹽（S1P）在卵巢癌細胞株（SKOV3）中的分泌水平的影響，探索其對卵巢癌細胞促血管生成的作用和可能

13、的機制。
　　研究方法：
　　1.設計合成干擾序列基因沉默SphK1，管腔形成實驗檢測基因沉默SphK1后的卵巢癌細胞培養(yǎng)基對人臍靜脈細胞融合細胞（EA.hy926細胞）血管形成的影響；
　　2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測SphK1基因沉默對卵巢癌細胞株S1P分泌水平的影響；
　　3.Realtime-PCR檢測S1P對無血清培養(yǎng)基饑餓處理24小時卵巢癌細胞株促血管生成作用的影響（白細胞介素IL-8）；<

14、br>　　4.設計合成干擾序列基因沉默S1PR1-S1PR3，Realtime-PCR檢測S1PR基因沉默對卵巢癌細胞株促血管生成作用的影響（IL-8）。
　　研究結果：
　　1.基因沉默SphK1后的卵巢癌細胞培養(yǎng)基使EA.hy926細胞株管腔形成明顯減少（P＜0.05)；
　　2.SphK1基因沉默可顯著降低卵巢癌細胞株(SKOV3)S1P分泌水平(P＜0.05)；
　　3.S1P可促進卵巢癌細胞株SKOV3

15、 IL-8的表達(P＜0.05)；
　　4.S1PR1、S1PR3基因沉默S1PR1、S1PR3可抑制卵巢癌細胞株IL-8的表達（P＜0.05)，而S1PR2基因沉默對卵巢癌細胞株IL-8的表達影響不明顯（P>0.05）。
　　結論：
　　SphK1在卵巢癌的血管生成過程中發(fā)揮重要作用。基因沉默SphK1能夠抑制卵巢癌細胞S1P的分泌以及腫瘤血管生成，證實SphK1可通過調節(jié)S1P影響卵巢癌血管生成。S1P可能通過刺激

16、卵巢癌細胞白細胞介素IL-8的分泌從而發(fā)揮促進血管生成效應。S1P的生物學效應取決于與其結合的特異性受體的亞型，S1PR1、S1PR3沉默可降低卵巢癌細胞IL-8的分泌，而基因沉默S1PR3對IL-8的分泌影響不大，表明S1P可能通過S1PR1、S1PR3兩種特異性受體調節(jié)IL-8的表達從而參與卵巢癌血管生成的雙向調控作用。
　　第三部分SphK1對裸鼠卵巢癌組織血管生成的作用研究
　　研究目的：
　　研究鞘氨醇激酶1

17、（SphK1）在裸鼠皮下瘤中的表達水平，探索SphK1及其抑制劑對裸鼠卵巢癌組織血管生成的作用。
　　研究方法：
　　建立裸鼠卵巢癌皮下成瘤模型，并設立SKI-II藥物處理組與對照組（生理鹽水組），監(jiān)測裸鼠皮下瘤生長情況，檢測裸鼠體重，觀察實驗組與對照組皮下成瘤情況，成瘤直徑、腫瘤體積、腫瘤質量，通過免疫組化觀察皮下瘤卵巢癌組織SphK1蛋白及CD34蛋白表達水平并計數(shù)MVD。
　　研究結果：
　　1.SKI-I