PARP-1對(duì)卵巢癌血管生成、增殖的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、背景和目的：
　　卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，具有高度侵襲性，且發(fā)病隱匿，超過70％的患者就診時(shí)已為晚期，預(yù)后差。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以鉑類和紫杉醇為主的化療是目前卵巢癌的一線治療方案，但是化療耐藥及腫瘤復(fù)發(fā)使傳統(tǒng)治療面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。因此，卵巢癌的分子靶向治療是近年來國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2]。目前分子靶向制劑大多是與腫瘤異常靶分子結(jié)合的單克隆抗體或小分子蛋白激酶抑制劑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制血管生成等，特異性高且毒性小。

2、r>　　PARP-1是存在于多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)、具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基(PAR)催化活性的蛋白酶，在DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、染色體功能、基因組穩(wěn)定和細(xì)胞死亡等方面均發(fā)揮重要作用[3]。本課題前期研究表明，PARP-1在卵巢癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，應(yīng)用PARP-1抑制劑可增強(qiáng)卵巢癌耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[4]。Pyriochou等[5]研究證實(shí)，PARP-1抑制劑PJ34可抑制雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)(CAM)的血管生成，有關(guān)PARP-

3、1是否對(duì)卵巢癌的血管生成產(chǎn)生影響的報(bào)道較少。
　　本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PARP-1、VEGF-A、MVD在上皮性卵巢癌中的表達(dá)，分析PARP-1與VEGF-A、MVD表達(dá)的相關(guān)性，并通過RNA干擾沉默SKOV3細(xì)胞的PARP-1基因，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞VEGF-A的表達(dá)變化以及對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外成管能力的影響，探討PARP-1對(duì)卵巢癌血管生成、增殖的影響，從而為PARP-1的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

4、>　　方法：
　　1.采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)60例上皮性卵巢癌原發(fā)灶中PARP-1、VEGF-A、MVD的表達(dá)及30例正常卵巢對(duì)照組織中PARP-1的表達(dá)，根據(jù)組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)將卵巢癌組織分為PARP-1陽性組、PARP-1陰性組。
　　2.RNA干擾沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞的PARP-1基因，將細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組(NC-siRNA組)、轉(zhuǎn)染PARP-1siRNA組（PARP1-siRNA組）。
　　3

5、.體外成管實(shí)驗(yàn)觀察沉默PARP-1對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外成管能力的影響。
　　4.MTT法檢測(cè)NC-siRNA組、PARP1-siRNA組細(xì)胞的增殖活性。
　　5.實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-RCR)檢測(cè)PARP-1及VEGF-AmRNA表達(dá)，蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PARP-1及VEGF-A蛋白表達(dá)。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中VEGF-A的含量。
　　結(jié)果：
　　1.PARP-

6、1、VEGF-A、MVD在上皮性卵巢癌中的表達(dá)PARP-1陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，卵巢癌組織中PARP-1陽性率為73.3％(44/60)，正常卵巢對(duì)照組織中PARP-1陽性率為26.7％(8/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。VEGF-A陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，在所有檢測(cè)的卵巢癌標(biāo)本中全部表達(dá)，評(píng)分位于1-6分，均值為(3.05±1.61)分。CD34標(biāo)記的MVD顯示，所有卵巢癌標(biāo)本的MVD均值為19.14±6.24。

7、r>　　2.PARP-1與卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系PARP-1在腫塊＜2cm組的陽性率顯著低于腫塊＞2cm組(P＜0.05)，在高中分化組的陽性率顯著低于低分化組(P＜0.05)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)，而在不同臨床分期組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.上皮性卵巢癌中PARP-1與VEGF-A、MVD的相關(guān)性VEGF-A評(píng)分均值PARP-1陽性組(3.80±1.69)高

8、于PARP-1陰性組(2.30±1.16)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MVD均值PARP-1陽性組(23.86±4.67)高于PARP-1陰性組(14.43±3.26)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)慢病毒載體中攜帶綠色熒光蛋白GFP，在倒置熒光顯微鏡下，成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)綠色熒光，轉(zhuǎn)染12h后可見熒光表達(dá)，72h熒光強(qiáng)度最高，NC-siRNA組、PARP1-siRNA組的轉(zhuǎn)染效率分別為89％

9、、86％。
　　5.RNA干擾對(duì)HUVEC體外成管的影響提取轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞的上清液分別培養(yǎng)HUVEC，結(jié)果顯示，體外成管數(shù)目NC-siRNA組(14.67±1.21)高于PARP1-siRNA組(8.83±1.47)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　6.RNA干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果表明，PARP1-siRNA組細(xì)胞增殖活性減弱，在48h、72h、96h，與NC-siRNA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

10、5)。
　　7.RNA干擾對(duì)PARP-1mRNA及蛋白的抑制作用與NC-siRNA組相比，PARP1-siRNA組PARP-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P＜0.05)，以actin為內(nèi)參照，NC-siRNA組、PARP1-siRNA組PARP-1蛋白表達(dá)量分別為0.93±0.22、0.38±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明成功構(gòu)建了PARP-1基因沉默的細(xì)胞模型。
　　8.RNA干擾對(duì)VEGF-AmRNA

11、及蛋白表達(dá)的影響PARP-1基因被沉默后，PARP1-siRNA組VEGF-AmRNA水平較NC-siRNA組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，NC-siRNA組、PARP1-siRNA組VEGF-A蛋白表達(dá)量分別為:0.90±0.18、0.41±0.08，PARP1-siRNA組較NC-siRNA組表達(dá)下降(P＜0.05)。表明siRNA沉默PARP-1基因后，VEGF-A在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均下