MALAT-1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的初步探討.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大最常見的惡性腫瘤，其中卵巢癌的惡性程度最高。因其發(fā)病隱匿、癥狀不典型、缺少有效的早期篩查手段，致使75％的患者就診時(shí)多處于卵巢癌進(jìn)展期（III/ IV），多數(shù)伴有腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移[1]。目前，手術(shù)聯(lián)合放、化療的綜合治療方式對卵巢癌的治療有顯著效果，80%的患者對鉑/紫杉醇類化療藥物敏感，但大部分患者在治療后短時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)。長期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌患者的5年生存率高達(dá)80%以上

2、，而晚期卵巢癌患者的5年生存率則徘徊在10%-30%[2-4]。因此，卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重威脅了患者的生命健康，也是治療過程中最大的難題。目前臨床尚無判斷卵巢癌患者易侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，不能很好地指導(dǎo)臨床醫(yī)生對患者病情的全面掌握及對患者預(yù)后的科學(xué)判斷。因此尋找有效的能早期預(yù)測卵巢癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的分子學(xué)標(biāo)志物，探索卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子學(xué)機(jī)制以獲取有效的治療靶點(diǎn)是改善卵巢癌患者預(yù)后的重要研究課題。
　　繼miRNA的大量研

3、究后，轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt的長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）在腫瘤中發(fā)揮的作用已引起極大關(guān)注。雖然LncRNAs不編碼或僅具有少量蛋白編碼功能，但它們在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)具有特異性，在哺乳動(dòng)物的進(jìn)化過程中高度保守，這提示LncRNA可能具有重要的生物學(xué)功能。近年來一系列的研究發(fā)現(xiàn) LncRNA以RNA形式通過調(diào)控基因表達(dá)參與了X染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄干擾和激活以及核內(nèi)運(yùn)輸?shù)纫幌盗兄匾?/p>

4、的調(diào)控過程，廣泛參與了近乎人體所有生理及病理過程，其異常表達(dá)與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[5]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄體1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT-1)是2003年在研究肺腺癌中發(fā)現(xiàn)并命名的與肺腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)的 LncRNA[6]，該基因的異常高表達(dá)與肝癌[7]、乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、胰腺癌[10]、膀胱癌[11,12]等其他

5、眾多人類實(shí)體腫瘤的進(jìn)展也有密切關(guān)系，扮演促腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的角色。在一項(xiàng)關(guān)于17種人類正常組織和惡性腫瘤組織的大規(guī)模基因微陣列芯片技術(shù)檢測顯示，在食管、膽囊、腦、骨髓、卵巢等組織的惡性腫瘤中MALAT-1的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)[13]。目前，國內(nèi)外關(guān)于MALAT-1與卵巢癌的研究甚少，MALAT-1是否異常表達(dá)于卵巢癌組織、是否影響了卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為、是否扮演了促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的角色及其作用機(jī)制如何等眾多問題尚不清楚，有待進(jìn)一步探

6、討。
　　研究目的:
　?。?）以期獲得能預(yù)測卵巢癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的MALAT-1分子標(biāo)志物；
　　（2）體外水平探討MALAT-1對卵巢癌細(xì)胞OVCAR3生物學(xué)行為的影響；
　?。?）論證MALAT-1靶向調(diào)控MMP19,ADAMTS1,MMP13基因的表達(dá)發(fā)揮促卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為尋求卵巢癌治療新靶點(diǎn)提供充分的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1、采用qRT-PCR技術(shù)檢測25例正常卵巢組織、

7、30例上皮性卵巢癌組織中MALAT-1 mRNA的表達(dá)并分析其表達(dá)的高低與患者年齡，F(xiàn)IGO分期、組織類型、分化程度、腹水、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理因素的相關(guān)性；
　　2、采用qRT-PCR檢測A2780、SKOV3、ES-2、OVCAR3四株卵巢癌細(xì)胞株中MALAT-1 mRNA的表達(dá)情況，篩選出高表達(dá)MALAT-1基因的細(xì)胞株；
　　3、生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)檢測shRNA介導(dǎo)沉默MALAT-1表達(dá)后對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

8、　　a)CCK-8比色法檢測細(xì)胞生長曲線的改變；
　　b)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞粘附能力的改變；
　　c)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力的改變；
　　4、基因表達(dá)譜芯片篩選差異表達(dá)基因，初步探討MALAT-1促卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以??±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Fisher確切概率法和Student

9、’s t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析和LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、MALAT-1 mRNA在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織（p<0.05）；MALAT-1 mRNA表達(dá)的高低與患者年齡、組織學(xué)類型、分化程度、FIGO分期、是否腹水無關(guān)（p>0.05）；在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）；
　　2、MAL

10、AT-1在四株卵巢癌細(xì)胞：A2780、SKOV3、ES-2、OVCAR3中均有表達(dá)，OVCAR3細(xì)胞中表達(dá)最高；
　　3、shRNA介導(dǎo)沉默 MALAT-1的表達(dá)可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3的增殖、粘附、劃痕修復(fù)以及遷移、侵襲能力；
　　4、抑制OVCAR3細(xì)胞中MALAT-1的表達(dá)后MMP19,ADAMTS1mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，MMP13mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、