XAF1在卵巢癌組織中的表達(dá)及作用機制的實驗研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡受阻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在多細(xì)胞的有機體中，細(xì)胞增殖和凋亡之間存在著動態(tài)平衡，當(dāng)平衡被打破，則可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Caspases(Cysteine aspartate-specific proteases天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶)家族是凋亡的執(zhí)行者，凋亡調(diào)控蛋白可直接或間接通過調(diào)節(jié)caspases活性而改變細(xì)胞活性。細(xì)胞凋亡抑制因子家族(Inhibitor of Apoptosis Proteins，I

2、APs)是一類凋亡抑制蛋白家族，具有抑制細(xì)胞凋亡作用。XIAP(X-linked Inhibitor ofApoptosis)是IAP家族中抑制caspases活性作用最強、作用范圍最廣的一員，能夠同時抑制caspases凋亡通路中的起始階段和效應(yīng)階段。文獻(xiàn)報道XIAP在黑色素瘤，直腸癌等多種惡性腫瘤中過度表達(dá)，且與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)。XIAP在上皮性卵巢中表達(dá)與臨床分期、細(xì)胞分級及生存期相關(guān)。抑制XIAP表達(dá)能增強腫瘤細(xì)胞如卵巢癌細(xì)胞對

3、化療藥物的敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞生長。體外實驗證實降低XIAP表達(dá)能抑制裸鼠移植瘤生長。
　　 XAF1(XIAP Associated Factor1)是在2000年通過與XIAP的酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)的一個基因，可以直接結(jié)合XIAP并抑制其抗caspases的活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。XIAP主要分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核周圍區(qū)域，XAF1定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，XAF1表達(dá)可使XIAP重新分布，從胞漿移位到胞核內(nèi)，從而阻斷了對caspases

4、的結(jié)合。文獻(xiàn)報道XAFI在多種腫瘤中表達(dá)降低或缺失，并與臨床及病理指標(biāo)有一定相關(guān)性，如黑色素瘤、肝癌、胃癌及直腸癌等，表明XAF1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在卵巢癌中無相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究選取進(jìn)展期上皮性卵巢癌(Ⅱ-Ⅲ)(EOC)及卵巢囊腺瘤組織，采用免疫組化的方法檢測促凋亡因子XAF1和凋亡抑制因子XIAP的表達(dá)，探討兩者表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征、預(yù)后及微血管密度(Microvessel Density, MVD)的關(guān)系。
　

5、　 XAF1能抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，增加肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性。XAF1過度表達(dá)能誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞凋亡，顯著增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。順鉑(Cisplatin)是第一代的鉑類抗腫瘤藥物，具有廣泛的抗腫瘤作用，其抗腫瘤的作用強且活性高，與其它抗腫瘤藥物少有交叉耐藥性。目前卵巢癌術(shù)后化療首選紫杉醇加鉑類藥物，逐漸出現(xiàn)的化療耐藥已成為影響卵巢癌臨床治療效果的重要障礙。XAF1基因表達(dá)缺失的卵巢癌細(xì)胞SKOV

6、3對順鉑具有天然的耐藥性，本研究以SKOV3細(xì)胞為研究對象，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，提高XAF1表達(dá)，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡及對順鉑耐藥性的影響，探討其作用機制，為尋找卵巢癌治療的新靶點提供理論依據(jù)。
　　 第一部分:XAF1和XIAP在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義
　　 研究目的:
　　 檢測促凋亡因子XAF1和凋亡抑制因子XIAP在上皮性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)，探討XAF1及XIAP的表達(dá)與患者臨床病理特征、預(yù)后及M

7、VD的關(guān)系。
　　 資料方法:
　　 選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2003年9月至2008年12月手術(shù)切除的上皮性卵巢癌（Ⅱ-Ⅳ期）組織共94例、卵巢囊腺瘤組織30例，行免疫組化染色，檢測XAF1和XIAP在EOC及卵巢囊腺瘤組織中的表達(dá)，行CD31抗體染色，檢測組織中微血管密度(MVD)。收集患者完整的臨床信息，包括患者的年齡、FIGO(FederationIntemational of Gynecology and Obst

8、etrics)分期、病理類型、細(xì)胞分級、是否存活等并對其進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.XAF1和XIAP在卵巢腫瘤組織中的表達(dá)
　　 免疫組化結(jié)果顯示XAF1在卵巢上皮細(xì)胞漿中表達(dá)，細(xì)胞核中幾乎無表達(dá)，EOC細(xì)胞中XAF1表達(dá)強度及廣度均低于卵巢囊腺瘤(3.35±2.54 vs.5.63±2.72;p＜0.001)。XIAP在卵巢上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，卵巢囊腺瘤上皮細(xì)胞中XIAP著色強度及廣度明顯低于EO

9、C細(xì)胞(2.13±2.11 vs.3.87±2.46; p＜0.001)。
　　 2.XAF1和XIAP在EOC組織中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系
　　 XAF1蛋白表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞分級有關(guān)，高中分化細(xì)胞(G1、G2)中XAF1高表達(dá)率為54.3％(19/35)，低分化細(xì)胞(G3)中XAF1高表達(dá)率為30.5％(18/59)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。FIGO分期為Ⅲ及Ⅳ期的卵巢癌患者中XAF1高表達(dá)率為33.8％(

10、23/68)，低于Ⅱ期患者(53.8％，14/26)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.099)。XIAP蛋白表達(dá)與患者年齡、FIGO分期、組織病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和細(xì)胞分級等臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。
　　 3.XAF1和XIAP在EOC組織中表達(dá)與組織微血管密度(MVD)的相關(guān)性分析
　　 EOC組織中MVD的中位值為12/HPF(3-31)((×)400)，XAF1在EOC中蛋白表達(dá)與MVD密切相關(guān)，XAF1低表達(dá)組中M

11、VD明顯高于XAF1高表達(dá)組（15.46±7.48 vs.10.95±5.33），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。XIAP低表達(dá)組MVD低于XIAP高表達(dá)組(12.65±6.39 vs.14.80±7.60)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.141)。
　　 4.XAF1和XIAP在EOC組織中表達(dá)及MVD對患者預(yù)后的影響
　　 單因素生存分析顯示XAF1高表達(dá)組中位生存時間明顯長于XAF1低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p

12、=0.013)。XIAP低表達(dá)組中位生存時間長于高表達(dá)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.102)。低MVD組中位生存時間明顯長于高M(jìn)VD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.027)。在其他單因素生存分析中，低分化者、Ⅲ-Ⅳ期患者中位生存期明顯短于高中分化患者、Ⅱ期患者(p＜0.05)。COX回歸模型進(jìn)行多因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期是進(jìn)展期EOC的獨立預(yù)后因素(p=0.041)，而XAF1、XIAP表達(dá)、MVD及細(xì)胞分級均不是進(jìn)展期EOC的獨

13、立預(yù)后因素。
　　 結(jié)論:
　　 1.EOC上皮細(xì)胞核及胞漿中XAF1表達(dá)較卵巢良性腫瘤降低而XIAP胞漿表達(dá)升高。
　　 2.XAF1表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞惡性行為及患者預(yù)后相關(guān)。
　　 3.XAF1可能參與腫瘤新生血管形成。
　　 第二部分XAF1對SKOV3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機制
　　 研究目的:
　　 通過基因工程技術(shù)上調(diào)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中XAF1的表達(dá)，檢測XAF

14、1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生物學(xué)行為及對順鉑耐藥性的影響，探討XAF1在卵巢癌中的作用機制。
　　 研究方法:
　　 脂質(zhì)體2000介導(dǎo)XAF1基因轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，G418篩選陽性克隆;Real-timeRT-PCR及western blot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中XAF1的表達(dá);采用四甲基偶氮唑鹽(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，

15、MTT)法檢測轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;Westem blot法檢測細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.穩(wěn)定表達(dá)XAF1基因的SKOV3細(xì)胞株的建立
　　 收集含重組質(zhì)粒的菌液10ml，對重組XAF1質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果顯示該質(zhì)粒與Homo sapiens XIAP associated factor1(XAF1), transcript variant1 mRNA(NCBI

16、Reference Sequence: NM_017523.2) CDS區(qū)100％匹配。
　　 經(jīng)過4周G418篩選獲得XAF1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株SKOV3/XAF1及空載體對照組SKOV3/Con。Real-time RT-PCR及western blot檢測結(jié)果表明細(xì)胞SKOV3/XAF1中XAF1的mRNA及蛋白表達(dá)水平較SKOV3/Con顯著增高。
　　 2.XAF1過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞的生長抑制作用
　　

17、 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測SKOV3/Con及SKOV3/XAF1的細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，SKOV3/XAF1細(xì)胞增殖在培養(yǎng)的第2-4天較對照組明顯減慢(p＜0.05)，第1天兩組細(xì)胞增殖無顯著性差異(p＞0.05)。
　　 3.XAF1過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響
　　 AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，SKOV3/XAF1細(xì)胞早期加晚期凋亡率較SKOV3/Con細(xì)胞明顯增

18、加(9.62±1.51％ vs.5.44±1.11％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 4.順鉑對SKOV3細(xì)胞生長抑制及凋亡的影響
　　 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測順鉑對SKOV3細(xì)胞的生長抑制作用，結(jié)果顯示:順鉑作用48h后，0.1μM組SKOV3/Con及SKOV3/XAF1細(xì)胞的生長抑制率分別為11.6±2.30％和18.80±5.07％;1μM組SKOV3/Con及SKOV3/XAF1細(xì)胞生長抑制

19、率分別為14.20±3.90％和25.00±4.06％;5μM組SKOV3/Con及SKOV3/XAF1細(xì)胞生長抑制率分別為19.60±1.82％和36.00±4.85％;10μM組SKOV3/Con及SKOV3/XAF1細(xì)胞生長抑制率分別為46.8±6.06％和61.20±3.27％。不同濃度的順鉑對SKOV3/XAF1組細(xì)胞的抑制率明顯高于SKOV3/Con組(p＜0.05; p＜0.01)。
　　 5μM順鉑作用48h后S

20、KOV3/XAF1細(xì)胞早期加晚期凋亡率明顯高于SKOV3/Con細(xì)胞(37.75±5.85％ vs.19.00±1.83％)(p＜0.01)。
　　 5.XAF1過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 將SKOV3/Con及SKOV3/XAF1細(xì)胞提取蛋白，行western blot檢測相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與SKOV3/Con相比，SKOV3/XAF1細(xì)胞中XIAP蛋白表達(dá)降低，胞漿中細(xì)胞色素C表

21、達(dá)升高;caspase-3活性裂解片段p17和p11的表達(dá)量升高。
　　 結(jié)論:
　　 1.XAF1過表達(dá)能抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖，促進(jìn)其凋亡，提高SKOV3細(xì)胞對順鉑的敏感性。
　　 2.XAF1過表達(dá)通過下調(diào)XIAP表達(dá)，上調(diào)胞漿細(xì)胞色素C表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分XAF1對SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響
　　 研究目的:
　　 建立裸鼠卵巢癌細(xì)胞移植瘤模型，將

22、SKOV3/Con、SKOV3/XAF1兩種卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，觀察兩組移植瘤生長情況，及兩組裸鼠移植瘤組織MVD及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)。
　　 研究方法:
　　 實驗動物選用雌性BALB/c-nude裸鼠，鼠齡4-5周，在無菌SPF級的動物培養(yǎng)設(shè)備中飼養(yǎng)。30只裸鼠隨機分為兩組，對照組15只皮下注射SKOV3/Con細(xì)胞，實驗組15只皮下注射SKOV3/XAF1細(xì)胞，建立裸鼠模型。荷瘤裸鼠接種細(xì)胞后，每日觀察裸鼠的

23、精神狀況、皮膚、飲食、活動等，每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的長徑(a)和短徑(b)一次，并計算腫瘤體積，計算公式為V=a×b2×0.5，連續(xù)飼養(yǎng)6周后脫臼處死后剝除腫瘤稱重。取下的瘤體部分用福爾馬林固定，制作石蠟切片，行HE染色及免疫組化CD31染色。新鮮瘤體提取蛋白，western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.XAF1過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的的影響
　　 接種后裸鼠

24、皮下形成的柔軟皮丘慢慢吸收、逐漸消退。SKOV3/Con組裸鼠在第一周末開始出現(xiàn)可觸及的瘤體，后生長迅速，在接種3周之后，裸鼠體重增長緩慢，后期體重下降，消瘦。SKOV3/XAF1組在第三周開始出現(xiàn)可觸及瘤體且生長緩慢，裸鼠食欲較好，體重增長較快。六周后SKOV3/Con組15只裸鼠全部成瘤，SKOV3/XAF1組11只成瘤。
　　 脫臼處死裸鼠，剝除皮下移植瘤，測量長短徑并稱重，SKOV3/Con組腫瘤體積為1984±128.

25、6mm3，SKOV3/XAF1組腫瘤體積為585.2±372.4mm3，SKOV3/Con組腫瘤體積明顯大于SKOV3/XAF1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。SKOV3/Con組瘤體重1.82±0.14克，SKOV3/XAF1組瘤體重0.49±0.35克，SKOV3/Con組瘤重明顯大于SKOV3/XAF1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 2.XAF1過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤MVD的影響
　　

26、 裸鼠移植瘤免疫組化染色結(jié)果顯示:SKOV3/XAF1組MVD明顯低于SKOV3/Con組(p＜0.05)。
　　 3.XAF1過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
　　 應(yīng)用western blot檢測裸鼠移植瘤相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示:SKOV3/XAF1組XAF1蛋白表達(dá)較對照組升高，XIAP蛋白表達(dá)降低，胞漿cyto C蛋白表達(dá)增強，caspase-3活性片段表達(dá)增強。
　　 結(jié)