FoxM1在卵巢癌中的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一,由于缺乏有效的早期診斷方法,死亡率仍然位于女性生殖器惡性腫瘤之首[1],75％的患者確診時(shí)已到晚期,五年生存率僅為30%-40%[2]。目前對(duì)卵巢癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案是在腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上施以紫杉醇與鉑類藥物為主的聯(lián)合化療,然而隨著耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn),常常使治療無(wú)效,已成為嚴(yán)重威脅女性生命的最大疾患。因此,卵巢癌的預(yù)防和治療已成為婦科腫瘤研究的最重要課題之一。
　　FoxM

2、1為Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族重要的成員之一,是與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子。它由10個(gè)外顯子構(gòu)成,且定位在約20kb的染色體端粒位置12p13-3。FoxM1具有三種剪接異構(gòu)體,即FoxM1A,B和C,其中FoxM1B和C在癌組織中高表達(dá),在正常細(xì)胞和組織中低表達(dá)[3-5],發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活、促癌發(fā)生和發(fā)展的作用,而FoxM1A在癌組織中低表達(dá),發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能。作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,其主要功能為通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,加快

3、腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程;轉(zhuǎn)錄激活VEGF,促進(jìn)腫瘤血管的生成;轉(zhuǎn)錄激活MMP2、MMP9,促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。另外,大量的生物芯片研究表明FoxM1與卵巢癌密切相關(guān)[6]。因此,FoxM1是一個(gè)重要的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)于卵巢癌診斷及治療都具有重要意義。
　　在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中,轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最重要的環(huán)節(jié),它是通過(guò)特定的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的調(diào)控序列及其啟動(dòng)子的特異性結(jié)合才能有效的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。但是到目前還沒(méi)有關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子與FoxM1

4、基因核心啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合并能夠有效地調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)報(bào)道。因此,通過(guò)對(duì)FoxM1基因啟動(dòng)子的克隆,研究其表達(dá)調(diào)控的機(jī)制,為闡明FoxM1基因的生物學(xué)功能及與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。
　　目前普遍認(rèn)為,基因組DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),CpG島的局部甲基化是惡性腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象,它往往早于明顯的惡性表型出現(xiàn)。大量的研究證明了DNA甲基化可影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到含有CpG島的識(shí)別序列,從而調(diào)控基因的表達(dá)。

5、因此,研究FoxM1啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與卵巢癌的相關(guān)性,以及探討DNA甲基化對(duì)FoxM1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響,對(duì)于理解卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的意義,為卵巢癌的早期診斷及靶向治療提供新的思路。
　　目的:
　　1.明確FoxM1在卵巢癌細(xì)胞及卵巢癌組織中的表達(dá);
　　2.明確FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)域;
　　3.初步探討轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)FoxM1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;
　　4.確定在卵巢癌中,DN

6、A甲基化修飾與FoxM1表達(dá)調(diào)控的關(guān)系,評(píng)價(jià)FoxM1在卵巢癌的早期診斷和治療中應(yīng)用的可行性。
　　內(nèi)容及方法:
　　1.檢測(cè)FoxM1在卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌組組織中的表達(dá)
　　1)我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)了FoxM1在卵巢癌細(xì)胞系(HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70)中的表達(dá)水平。
　　2)同時(shí)我們運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)分別檢測(cè)了35例上

7、皮性卵巢癌組織、40例正常卵巢組織的表達(dá)情況。
　　2.確定FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)域
　　我們以正常人外周血基因組DNA為模板,用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增構(gòu)建了6個(gè)長(zhǎng)度不同但相互重疊的FoxM1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因系列截短載體,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)確定FoxM1基因核心啟動(dòng)子區(qū)域。
　　3.明確轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)FoxM1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　　我們用 Sp1基因真核表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告基因質(zhì)粒共

8、同分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞(順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和順鉑耐藥細(xì)胞系CP70),對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載體,運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)Sp1對(duì)FoxM1基因轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　4.DNA甲基化修飾與FoxM1基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系
　　我們運(yùn)用CpG島搜索軟件CpGPLOT分析了FoxM1的啟動(dòng)子序列,然后,我們用亞硫酸鹽克隆測(cè)序法檢測(cè)了卵巢癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8910PM,低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8910,順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)278

9、0和順鉑耐藥細(xì)胞系CP70的中FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況;同時(shí)我們又運(yùn)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)分別對(duì)15例上皮性卵巢癌組織、14例正常卵巢組織中FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況進(jìn)行了檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示FoxM1在卵巢癌細(xì)胞系(HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70)中均高表達(dá);同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化結(jié)果顯示FoxM1在卵巢癌組織中的表達(dá)水

10、平(30/35=86%)顯著高于正常卵巢組織(6/40=15%,P<0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且這種高表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上是一致的。
　　2.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)位于其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游+1～-95 bp這段序列中。
　　3.熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Sp1結(jié)合到FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)并對(duì)其有轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　4.亞硫酸鹽克隆測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果顯示,卵巢癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8

11、910PM,低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8910,順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和順鉑耐藥細(xì)胞系CP70四株細(xì)胞系中FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度均很低。另外,用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,15例上皮性卵巢癌組織、14例正常卵巢組織中FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)均存在著一定程度的低甲基化,且二者之間沒(méi)有明顯的差異(P>0.05),沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與其在卵巢癌細(xì)胞系中的甲基化程度基本一致。這些結(jié)果說(shuō)明,在卵巢癌中DNA甲基化修飾可能不參與FoxM1的表達(dá)調(diào)

12、控。
　　結(jié)論:
　　1.FoxM1在正常卵巢組織中低表達(dá)或者不表達(dá),而在四株卵巢癌細(xì)胞系和上皮性卵巢癌組織中的均高表達(dá),并且這種高表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上是基因一致的,提示FoxM1基因與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。
　　2.首次確定了FoxM1核心啟動(dòng)子區(qū)位于其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游+1bp~-95 bp這段序列中,為進(jìn)一步研究FoxM1與腫瘤關(guān)系的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　3.確定了Sp1上調(diào)FoxM1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),