miR-450a-5p在漿液性卵巢癌中的表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、上皮性卵巢癌是婦科最致命的惡性腫瘤，占所有卵巢癌75％~90%，其中漿液性卵巢癌又占全部上皮性卵巢癌的60%~70%。因早期階段的卵巢癌無(wú)明顯可察覺(jué)癥狀及體征，并且目前缺少有效的早期診斷及早期治療手段，故70％以上病人就診時(shí)已屬晚期，平均5年生存率低于30％，死亡率居所有女性生殖道癌癥的第一位。MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與了正常細(xì)胞的增殖，細(xì)胞分化，細(xì)胞代謝及細(xì)胞凋亡等生物生

2、理進(jìn)程，也與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。根據(jù)調(diào)控靶基因不同，miRNAs可作為抑癌基因或癌基因參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理進(jìn)程。目前miRNAs與漿液性卵巢癌的研究也有報(bào)道，但作用機(jī)理尚不十分明確。目前國(guó)外研究人員認(rèn)為，漿液性卵巢癌主要起源于輸卵管上皮，且以傘端多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)組前期以正常輸卵管傘端組織為對(duì)照，經(jīng)miRNA芯片篩選，發(fā)現(xiàn)miR-450a-5p在漿液性卵巢癌組織中表達(dá)量顯著下調(diào)，且其功能機(jī)制尚未在卵巢癌中研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)組

3、選取miR-450a-5p為研究分子，以正常人輸卵管傘端為對(duì)照，通過(guò)初步科學(xué)研究，希望miR-450a-5p能成為早期診斷、治療及預(yù)防漿液性卵巢癌的重要生物學(xué)分子?；谇捌谛酒Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)組擬：(1)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)大樣本中miR-450a-5p的表達(dá)差異情況，并分析miR-450a-5p各組表達(dá)水平和漿液性卵巢癌臨床病理特征之間的相關(guān)性；(2)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-450a-5p mimics構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR

4、-450a-5p的漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞系，通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)研究過(guò)表達(dá)的miR-450a-5p對(duì)SKOV3細(xì)胞系腫瘤生物學(xué)行為的影響；(3)通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（western blot）及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（dual-luciferase reporter gene assay）驗(yàn)證miR-450a-5p的靶基因及調(diào)控漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的可能分子信號(hào)通路機(jī)制，為臨床治療卵巢癌提供新的理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.

5、檢測(cè)miR-450a-5p在漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況，并分析miR-450a-5p的表達(dá)與漿液性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2.研究miR-450a-5p對(duì)人漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、周期、凋亡腫瘤生物學(xué)行為的影響。驗(yàn)證miR-450a-5p的靶基因，探討其在漿液性卵巢癌中發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.選取101例漿液性卵巢癌石蠟包埋組織及50例正常輸卵管傘端石蠟包埋組織。所有樣

6、本的選取均由2位資深病理專(zhuān)家判讀完成。
　　2.用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果，并分析miR-450a-5p表達(dá)水平和臨床病理特征分組之間相關(guān)性。
　　3.用miR-450a-5p mimics轉(zhuǎn)染人漿液性卵巢癌 SKOV3細(xì)胞，構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-450a-5p的細(xì)胞系，并設(shè)陰性對(duì)照組(NC)及空白對(duì)照組(Blank)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力、Transwell

7、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡。
　　4.使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-450a-5p可能調(diào)控的靶基因，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選定靶基因。
　　5.用western blot及dual-luciferase reporter gene assay驗(yàn)證miR-450a-5p可能的靶基因。
　　6.結(jié)果采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05差異認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)

8、果：
　　1. MiR-450a-5p在漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常輸卵管傘端組織。
　　2. MiR-450a-5p的表達(dá)水平與漿液性卵巢癌臨床病理特征之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3. MTT實(shí)驗(yàn)：過(guò)表達(dá)miR-450a-5p組細(xì)胞增殖活力與NC組、blank組無(wú)明顯差異，提示了miR-450a-5p對(duì)SKOV3細(xì)胞系的增殖活力無(wú)明顯影響。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)均顯示轉(zhuǎn)染miR-450a-5p

9、 mimics后，細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯減弱，提示過(guò)表達(dá)的miR-450a-5p不僅抑制了SKOV3細(xì)胞系的遷移能力，對(duì)其侵襲能力也有抑制。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：MiR-450a-5p mimics組細(xì)胞遷移能力較NC組、blank組降低，提示過(guò)表達(dá)的miR-450a-5p抑制了SKOV3細(xì)胞系的遷移能力。流式細(xì)胞術(shù)：過(guò)表達(dá)miR-450a-5p后，mimics組細(xì)胞周期明顯被阻滯于G1期MiR-450a-5p mimics組、NC組、bla

10、nk組凋亡結(jié)果無(wú)明顯差異。
　　4.通過(guò)生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-450a-5p靶基因并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，分析DUSP10可能為miR-450a-5p的靶基因。
　　5.通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-450a-5p mimics組DUSP10蛋白表達(dá)水平顯著性降低；Dual-luciferase reporter gene assay實(shí)驗(yàn)提示miR-450a-5p的靶基因?yàn)镈USP10。
　　結(jié)論：
　　1

11、.以正常輸卵管傘端為對(duì)照，經(jīng)大樣本驗(yàn)證，miR-450a-5p在漿液性卵巢癌中呈顯著性低表達(dá)，提示miR-450a-5p可能參與了漿液性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。
　　2.過(guò)表達(dá)漿液性卵巢癌SKOV3細(xì)胞系miR-450a-5p后，可降低SKOV3細(xì)胞侵襲及遷移能力，并將細(xì)胞周期阻滯于G1期。
　　3.MiR-450a-5p靶基因可能為DUSP10，通過(guò)miR-450a-5p/DUSP10/MAPKs通路調(diào)節(jié)漿液性卵巢癌進(jìn)展。