Basigin剪接變異體在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及相關(guān)功能研究.pdf

1、研究背景:
　　在大多數(shù)國家中,卵巢癌是女性最致命的婦科惡性腫瘤之一[1]。其中又以上皮性卵巢癌最常見,大約占卵巢惡性疾病的70％,女性惡性腫瘤中居第六位,癌癥相關(guān)死亡原因居第五位[2]。大多數(shù)患者早期無明顯癥狀,70%患者發(fā)現(xiàn)時已屬晚期[3]。在過去幾十年里,盡管手術(shù)聯(lián)合化療等治療手段的不斷進(jìn)步,但卵巢癌復(fù)發(fā)率和死亡率仍然很高[4-5]。其五年生存率僅有30-40%[6],死亡率居婦科惡性腫瘤首位。因此,迫切的尋求對抗卵巢癌的生

2、物標(biāo)志物,以便更好的早期診斷和早期治療是目前研究的重點(diǎn)。
　　Basigin(CD147,EMMPRIN,neurothelin,5A11,gp42,OX-47,CE9)是一種高度糖基化的單次跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族粘附分子(IgSF)成員[7-8],分子量58KDa,有四種剪接變異體。Basigin最為主要的功能是刺激腫瘤細(xì)胞及其周圍成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移

3、[9-10]。此外,Basigin的功能還包括胚胎發(fā)育、T細(xì)胞活化、生殖、神經(jīng)及視網(wǎng)膜功能。Basigin在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Basigin的高表達(dá)還與卵巢癌患者的預(yù)后不良有關(guān),可作為卵巢癌獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　Basigin具有4個剪接變異體,對于其剪接變異體的研究較少,其在卵巢癌的表達(dá)與功能如何是相關(guān)領(lǐng)域的研究前沿之一。本研究首次報道3種Basigin剪接變異體在卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌組

4、織中的表達(dá)情況,并且通過研究Basigin-2與臨床病理資料的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)Basigin-2與上皮性卵巢癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。我們進(jìn)一步在卵巢癌細(xì)胞系中驗(yàn)證了Basigin-2的生物學(xué)功能,初步評估了Basigin-2作為卵巢癌靶點(diǎn)的可行性,為卵巢癌的治療提供了新的思路。
　　目的:
　　1.明確Basigin剪接變異體在上皮性卵巢癌的表達(dá)情況。
　　2.明確Basigin-2的表達(dá)與上皮性卵巢癌的臨床病理特征及預(yù)后的

5、相關(guān)性。
　　3.明確Basigin-2對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法:
　　1.應(yīng)用RT-PCR、Taqman實(shí)時熒光定量-PCR、western-blot觀察Basigin剪接變異體在上皮性卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌組織中的表達(dá)。
　　2.Basigin-2的表達(dá)與其臨床病例因素間的關(guān)系及預(yù)后的相關(guān)性分析。
　　a)運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析Basigin-2在146例上皮性卵巢癌石蠟標(biāo)本組織中的表達(dá);

6、
　　b)運(yùn)用Kaplan Meier analysis和Cox proportional hazards model分析Basigin-2與臨床病例因素間的關(guān)系及預(yù)后的相關(guān)性分析。
　　3.pcDNA3.1-Basigin-2真核表達(dá)載體和SiRNA-Basigin-2分別轉(zhuǎn)染低轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-8910和高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-810PM,觀察轉(zhuǎn)染后Basigin-2的蛋白表達(dá),并用明膠酶譜法、Transwell侵襲

7、小室、劃痕試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。
　　結(jié)果:
　　1.觀察Basigin剪接變異體在上皮性卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌組織中的表達(dá)。
　　a)RT-PCR分析Basigin剪接變異體在五株上皮性卵巢癌細(xì)胞系的表達(dá):mRNA水平顯示Basigin-2,Basigin-3和Basigin-4在五種卵巢癌細(xì)胞系中均有表達(dá);
　　b)Taqman實(shí)時熒光定量PCR分析71例卵巢癌組織標(biāo)本和27例正常卵巢組織的Ba

8、sigin-2、Basigin-3、Basigin-4mRNA的表達(dá)結(jié)果:Basigin-2和Basigin-4在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常卵巢組織(Basigin-2,P<0.0001;Basigin-4,P=0.0129),Basigin-3的表達(dá)水平略有升高(P=0.2703),但無統(tǒng)計學(xué)意義;
　　c)Taqman實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果:Basigin-2和Basigin-4在低轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-8910

9、的表達(dá)水平低于高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM(P<0.05),但Basigin-2的平均拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于Basigin-4(約100倍),有統(tǒng)計學(xué)意義;Basigin-3mRNA在低轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-8910和高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM表達(dá)差異,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);
　　d)Western blot分析Basigin-2在五株卵巢癌細(xì)胞系的蛋白表達(dá):Basigin-2在五株卵巢癌細(xì)胞系中均有表達(dá),但在高

10、轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM表達(dá)水平明顯高于低轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株HO-8910。
　　2.Basigin-2的表達(dá)與其臨床病例因素間的關(guān)系及預(yù)后的相關(guān)性分析。
　　a)Basigin-2在146例上皮性卵巢癌組織病理切片中的表達(dá),Basigin-2主要分布在細(xì)胞膜上;
　　b)卵巢癌組織中的Basigin-2蛋白表達(dá)水平與淋巴血管間隙浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.012,P=0.017)。Basigin-2的表達(dá)水

11、平與患者年齡、FIGO分期、分級及組織病理學(xué)類型之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);
　　c)臨床病理資料分析說明在上皮性卵巢癌患者中Basigin-2高表達(dá)組的PFS和OS較短。
　　d)單因素Cox proportional分析,Basigin-2的表達(dá)與PFS和OS密切相關(guān),有統(tǒng)計學(xué)意義(PFS,P<0.001;OS,P=0.002);
　　e)多因素Cox proportional分析發(fā)現(xiàn)Basigin-2和FI

12、GO分期是PFS和OS的判斷預(yù)后的指標(biāo)。
　　3.pcDNA3.1-Basigin-2真核表達(dá)載體對卵巢癌細(xì)胞MMPs分泌、侵襲及遷移的生物學(xué)行為的影響
　　a)Western blot的蛋白表達(dá):Basigin-2蛋白在pcDNA3.1-Basigin-2傳染組的表達(dá)高于其對照組pcDNA3.1和空白組(P<0.05);
　　b)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果:pcDNA3.1-Basigin-2傳染HO-8910細(xì)胞后MMPs分

13、泌高于其對照組pcDNA3.1和空白組(P<0.05);
　　c)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:pcDNA3.1-Basigin-2傳染HO-8910細(xì)胞后與對照組pcDNA3.1和空白組相比,促進(jìn)了細(xì)胞的遷移能力(P<0.05);
　　d)細(xì)胞transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:pcDNA3.1-Basigin-2傳染HO-8910細(xì)胞后與對照組pcDNA3.1和空白組相比,促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05)。
　　4.Basig

14、in-2-siRNA特異性沉默Basigin-2的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞MMPs分泌、侵襲及遷移的的生物學(xué)行為的影響
　　a)Westernblot的蛋白表達(dá):Basigin-2蛋白在Basigin-2siRNA傳染組的表達(dá)低于其對照組和空白組(P<0.05);
　　b)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Basigin-2-siRNA傳染HO-8910細(xì)胞后MMPs分泌低于其對照組和空白組(P<0.05);
　　c)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Bas

15、igin-2-siRNA傳染HO-8910細(xì)胞后與對照組和空白組相比,抑制了細(xì)胞的遷移能力(P<0.05);
　　d)細(xì)胞transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Basigin-2-siRNA傳染HO-8910細(xì)胞后與對照組和空白組相比,抑制了細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05);
　　結(jié)論:
　　1.本研究確定了Basigin剪接變異體(Basigin-2、Basigin-3、Basigin-4)在卵巢癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,

16、證明Basigin-2和Basigin-4在卵巢癌組織中特異表達(dá),其中Basigin-2的表達(dá)量遠(yuǎn)高于Basigin-4,說明Basigin-2在卵巢癌的作用更為重要。
　　2.發(fā)現(xiàn)Basigin-2在卵巢癌中高表達(dá),Baigin-2的表達(dá)與卵巢癌的淋巴血管間隙浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),Basigin-2在卵巢癌的惡性潛能中起非常最要的作用。
　　3.Basigin-2與卵巢癌的FBS、OS有關(guān),Basigin-2表達(dá)陽性的患者