HSF1與XAF1對(duì)子宮內(nèi)膜癌的影響及作用機(jī)制的初步探究.pdf

1、背景:
　　子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)作為一組子宮內(nèi)膜上皮性惡性腫瘤嚴(yán)重威脅女性健康，以起源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最為多見(jiàn)。它是女性生殖系統(tǒng)最多見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)其每年的發(fā)病率約占女性生殖系統(tǒng)癌癥的20％～30%，且每年有接近20萬(wàn)的新發(fā)病例，發(fā)病率僅次于宮頸癌。但在一些西方發(fā)達(dá)國(guó)家有大樣本統(tǒng)計(jì)顯示其發(fā)病率遠(yuǎn)高于宮頸癌，在女性生殖系統(tǒng)癌癥排名首位。雖然目前EC的具體發(fā)病機(jī)理仍不完全明確，但隨

2、著近年來(lái)明顯上升的發(fā)病率及死亡率，其早已成為當(dāng)前基礎(chǔ)科研及臨床研究的焦點(diǎn)。
　　熱休克反應(yīng)是在熱應(yīng)激作用下發(fā)生的，以基因表達(dá)和調(diào)控變化為主要特性的一種防御應(yīng)激反應(yīng)。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor1，HSF1)為熱休克反應(yīng)的主要調(diào)控者。HSF1可通過(guò)直接或間接介導(dǎo)體內(nèi)許多細(xì)胞活性因子的生物活動(dòng)，參與調(diào)控細(xì)胞的多種生理機(jī)能。它的存在使機(jī)體在適應(yīng)不利環(huán)境盡可能延長(zhǎng)生存期的同時(shí)還參與細(xì)胞惡

3、性轉(zhuǎn)化，因此，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定推動(dòng)作用。
　　X-染色體連鎖凋亡抑制因子1(XIAPassociatedfactor1，XAF1)是一種可以拮抗X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)的重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可直接與XIAP結(jié)合而迅速阻斷其抑制凋亡的作用，從而逆轉(zhuǎn)XIAP對(duì)細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用。鑒于XAF1結(jié)構(gòu)和功能上

4、的眾多特質(zhì)，它已成為降低腫瘤細(xì)胞耐藥性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物、細(xì)胞因子治療和放射線治療敏感性的重要突破點(diǎn)。
　　細(xì)胞凋亡的阻滯與惡性腫瘤的發(fā)生及細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生關(guān)系密切，許多化療藥物都是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到清除腫瘤的目的。因此當(dāng)XAF1呈高水平表達(dá)時(shí)即可導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞的凋亡，顯著增強(qiáng)化療藥物的作用并有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和體內(nèi)腫瘤的形成。那么在子宮內(nèi)膜癌中HSF1與XAF1表達(dá)情況如何？這兩者之間具有怎樣的相關(guān)性？這兩者是否

5、對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡具有影響作用？
　　帶著這些疑問(wèn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中我們驗(yàn)證了HSF1與XAF1在子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了這兩者之間的相互關(guān)系，并于慢病毒感染后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中觀察細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及凋亡等的變化情況，探討此兩種分子在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探究，以期為子宮內(nèi)膜癌的及時(shí)診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供參考。
　　目的：
　　1.研究并探討HSF1與XAF

6、1在子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)及相互作用情況。
　　2.研究并探討HSF1與XAF1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響及作用。
　　方法
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織中HSF1與XAF1的表達(dá)情況以及在子宮內(nèi)膜癌不同分化水平狀態(tài)下HSF1與XAF1的表達(dá)情況。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析上述組織中HSF1、XAF1的表達(dá)與EC臨床病理特征的關(guān)系并對(duì)兩者的相關(guān)性進(jìn)行分析

7、。并通過(guò)對(duì)EC組織與正常子宮內(nèi)膜組織的western blot及qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行HSF1與XAF1基因蛋白水平及mRNA水平的檢測(cè)。
　　2.通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)子宮內(nèi)膜癌研究中常用的三株細(xì)胞(Ish-ikawa、HEC-1A、RL95-2)進(jìn)行HSF1與XAF1基因表達(dá)水平的檢測(cè)，選取表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2作為慢病毒感染模型，并成功構(gòu)建了穩(wěn)定干涉HSF1基因的細(xì)胞株和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)XAF1基因的細(xì)胞株。
　　

8、3.通過(guò)western blot及實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSF1干涉實(shí)驗(yàn)組Lv-sh-HSF1-RL95-2細(xì)胞中XAF1表達(dá)變化；同時(shí)檢測(cè)XAF1過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組Lv-XAF1-RL95-2細(xì)胞中HSF1表達(dá)變化。
　　4.通過(guò)MTT比色實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)及細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)來(lái)測(cè)試HSF1被干涉與XAF1基因被過(guò)表達(dá)后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2在增殖能力，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡中所出現(xiàn)的變化。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分，第一部分為HSF1基因干涉

9、組，具體分組如下：實(shí)驗(yàn)組Lv-sh-HSF1-RL95-2；組內(nèi)對(duì)照Lv-scramble-RL95-2；空白對(duì)照組control。第二部分為XAF1基因過(guò)表達(dá)組，具體分組如下：實(shí)驗(yàn)組Lv-XAF1-RL95-2；組內(nèi)對(duì)照Lv-cherry-RL95-2；空白對(duì)照組control。
　　結(jié)果：
　　1.子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織免疫組化染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組（正常子宮內(nèi)膜組織）相比較，HSF1基因在癌組織中的表達(dá)水平明

10、顯高于正常子宮內(nèi)膜組織；HSF1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)（P＜0.001）、肌層浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與手術(shù)病理分期不相關(guān)；XAF1在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)、手術(shù)病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。在初步驗(yàn)證了兩者在癌與非癌組織中的表達(dá)后，我們又在不同分化程度的癌組織中也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，免疫組化染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著癌組織分化水平的降低，HSF1基因

11、的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì)，而XAF1基因的表達(dá)則呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，以此結(jié)果我們?cè)O(shè)想它們很可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分別參與并起到了一定的作用，為了能夠進(jìn)一步的探尋其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過(guò)收集的完整病例資料進(jìn)行了相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示兩者之間呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.582，P＜0.001）。
　　2.體外環(huán)境中，HSF1及XAF1在子宮內(nèi)膜癌三株細(xì)胞中的表達(dá)水平通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在這

12、三株細(xì)胞中，Ish-ikawa中HSF1表達(dá)水平最高，RL95-2次之，HEC-1A最低，而XAF1在Ish-ikawa中表達(dá)水平最低，RL95-2次之，HEC-1A最高，因此我們選取了RL95-2細(xì)胞作為慢病毒感染的對(duì)象，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定和真實(shí)性，在實(shí)驗(yàn)條件下得到最準(zhǔn)確的結(jié)果。
　　3.HSF1干涉實(shí)驗(yàn)組Lv-sh-HSF1-RL95-2細(xì)胞中XAF1表達(dá)較對(duì)照組明顯增高；同時(shí)XAF1過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組Lv-XAF1-RL95-2

13、細(xì)胞中HSF1表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯變化。
　　4.基于前期HSF1及XAF1負(fù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及成功構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系為基礎(chǔ)，課題組通過(guò) MTT比色實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，在HSF1基因干涉組中實(shí)驗(yàn)組Lv-sh-HSF1-RL95-2組細(xì)胞的增殖能力明顯降低，而對(duì)照組Lv-scramble-RL95-2，control細(xì)胞的增殖能力顯著高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。在XAF1基因過(guò)表達(dá)組中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)XAF1的Lv- XAF1-RL95-2組

14、細(xì)胞增殖能力也相比較其他對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。
　　5.細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)分組同上，在HSF1基因干涉組中實(shí)驗(yàn)組與兩個(gè)對(duì)照組（Lv-scramble-RL95-2，control）相比較，實(shí)驗(yàn)組（Lv-sh-HSF1-RL95-2）出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯，進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)量減少，干涉HSF1基因后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 RL95-2出現(xiàn)了細(xì)胞周期阻滯。在XAF1基因過(guò)表達(dá)組中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)XAF1的Lv-XAF1-RL9

15、5-2組細(xì)胞與Lv-cherry-RL95-2組和control組相比較，實(shí)驗(yàn)組Lv-XAF1-RL95-2出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯，進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)量減少，穩(wěn)定過(guò)表達(dá) XAF1基因可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 RL95-2也同樣出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。
　　6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在XAF1基因過(guò)表達(dá)組中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)XAF1的Lv-XAF1-RL95-2組與Lv-cherry-RL95-2組和control組相比較，實(shí)驗(yàn)組Lv-XAF1-

16、RL95-2出現(xiàn)了明顯的早期凋亡趨勢(shì)（P＜0.001），這說(shuō)明穩(wěn)定過(guò)表達(dá) XAF1基因可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2在早期就出現(xiàn)大量凋亡。在HSF1基因干涉組中，實(shí)驗(yàn)組與兩個(gè)對(duì)照組（Lv-scramble-RL95-2，control）相比較，實(shí)驗(yàn)組（Lv-sh-HSF1-RL95-2）出現(xiàn)了與過(guò)表達(dá)組相一致的結(jié)果（P＜0.001），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡明顯增加，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明干涉HSF1基因后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2出現(xiàn)了細(xì)胞早期凋亡率

17、的增加。
　　結(jié)論：
　　HSF1及XAF1基因參與了多種人類相關(guān)疾病的進(jìn)展過(guò)程，其中就包括腫瘤。在多種腫瘤中都有其對(duì)細(xì)胞增殖，周期和凋亡中發(fā)揮作用的研究。目前，這兩者在子宮內(nèi)膜癌中的相互關(guān)聯(lián)以及這種關(guān)聯(lián)在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用還尚未有明確報(bào)道。本課題組通過(guò)對(duì)兩者的表達(dá)以及表達(dá)所存在的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其發(fā)生的機(jī)制，所有結(jié)果都提示在子宮內(nèi)膜癌中針對(duì)HSF1及XAF1基因?yàn)?/p>