HSF1與XAF1對子宮內(nèi)膜癌的影響及作用機制的初步探究.pdf

1、背景:
　　子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)作為一組子宮內(nèi)膜上皮性惡性腫瘤嚴重威脅女性健康，以起源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最為多見。它是女性生殖系統(tǒng)最多見的惡性腫瘤之一，在我國其每年的發(fā)病率約占女性生殖系統(tǒng)癌癥的20％～30%，且每年有接近20萬的新發(fā)病例，發(fā)病率僅次于宮頸癌。但在一些西方發(fā)達國家有大樣本統(tǒng)計顯示其發(fā)病率遠高于宮頸癌，在女性生殖系統(tǒng)癌癥排名首位。雖然目前EC的具體發(fā)病機理仍不完全明確，但隨

2、著近年來明顯上升的發(fā)病率及死亡率，其早已成為當(dāng)前基礎(chǔ)科研及臨床研究的焦點。
　　熱休克反應(yīng)是在熱應(yīng)激作用下發(fā)生的，以基因表達和調(diào)控變化為主要特性的一種防御應(yīng)激反應(yīng)。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor1，HSF1)為熱休克反應(yīng)的主要調(diào)控者。HSF1可通過直接或間接介導(dǎo)體內(nèi)許多細胞活性因子的生物活動，參與調(diào)控細胞的多種生理機能。它的存在使機體在適應(yīng)不利環(huán)境盡可能延長生存期的同時還參與細胞惡

3、性轉(zhuǎn)化，因此，對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定推動作用。
　　X-染色體連鎖凋亡抑制因子1(XIAPassociatedfactor1，XAF1)是一種可以拮抗X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)的重要的負性調(diào)節(jié)因子，可直接與XIAP結(jié)合而迅速阻斷其抑制凋亡的作用，從而逆轉(zhuǎn)XIAP對細胞包括腫瘤細胞的保護作用。鑒于XAF1結(jié)構(gòu)和功能上

4、的眾多特質(zhì)，它已成為降低腫瘤細胞耐藥性，提高腫瘤細胞對化療藥物、細胞因子治療和放射線治療敏感性的重要突破點。
　　細胞凋亡的阻滯與惡性腫瘤的發(fā)生及細胞耐藥性的產(chǎn)生關(guān)系密切，許多化療藥物都是通過誘導(dǎo)細胞凋亡而達到清除腫瘤的目的。因此當(dāng)XAF1呈高水平表達時即可導(dǎo)致大量腫瘤細胞的凋亡，顯著增強化療藥物的作用并有效抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化和體內(nèi)腫瘤的形成。那么在子宮內(nèi)膜癌中HSF1與XAF1表達情況如何？這兩者之間具有怎樣的相關(guān)性？這兩者是否

5、對腫瘤細胞的增殖及凋亡具有影響作用？
　　帶著這些疑問，我們設(shè)計了本實驗，實驗中我們驗證了HSF1與XAF1在子宮內(nèi)膜癌組織及細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)了這兩者之間的相互關(guān)系，并于慢病毒感染后的子宮內(nèi)膜癌細胞株中觀察細胞的增殖、細胞周期及凋亡等的變化情況，探討此兩種分子在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用并對其作用機制進行初步探究，以期為子宮內(nèi)膜癌的及時診斷、治療及預(yù)后評估提供參考。
　　目的：
　　1.研究并探討HSF1與XAF

6、1在子宮內(nèi)膜癌組織及細胞中的表達及相互作用情況。
　　2.研究并探討HSF1與XAF1對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，細胞周期及細胞凋亡的影響及作用。
　　方法
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織中HSF1與XAF1的表達情況以及在子宮內(nèi)膜癌不同分化水平狀態(tài)下HSF1與XAF1的表達情況。運用統(tǒng)計學(xué)方法分析上述組織中HSF1、XAF1的表達與EC臨床病理特征的關(guān)系并對兩者的相關(guān)性進行分析

7、。并通過對EC組織與正常子宮內(nèi)膜組織的western blot及qPCR實驗進行HSF1與XAF1基因蛋白水平及mRNA水平的檢測。
　　2.通過免疫印跡實驗對子宮內(nèi)膜癌研究中常用的三株細胞(Ish-ikawa、HEC-1A、RL95-2)進行HSF1與XAF1基因表達水平的檢測，選取表達量相對穩(wěn)定的子宮內(nèi)膜癌細胞RL95-2作為慢病毒感染模型，并成功構(gòu)建了穩(wěn)定干涉HSF1基因的細胞株和穩(wěn)定過表達XAF1基因的細胞株。
　　

8、3.通過western blot及實時定量PCR實驗檢測HSF1干涉實驗組Lv-sh-HSF1-RL95-2細胞中XAF1表達變化；同時檢測XAF1過表達實驗組Lv-XAF1-RL95-2細胞中HSF1表達變化。
　　4.通過MTT比色實驗，流式細胞儀檢測及細胞凋亡水平檢測來測試HSF1被干涉與XAF1基因被過表達后子宮內(nèi)膜癌細胞RL95-2在增殖能力，細胞周期及細胞凋亡中所出現(xiàn)的變化。實驗分為兩個部分，第一部分為HSF1基因干涉

9、組，具體分組如下：實驗組Lv-sh-HSF1-RL95-2；組內(nèi)對照Lv-scramble-RL95-2；空白對照組control。第二部分為XAF1基因過表達組，具體分組如下：實驗組Lv-XAF1-RL95-2；組內(nèi)對照Lv-cherry-RL95-2；空白對照組control。
　　結(jié)果：
　　1.子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織免疫組化染色結(jié)果顯示：與對照組（正常子宮內(nèi)膜組織）相比較，HSF1基因在癌組織中的表達水平明

10、顯高于正常子宮內(nèi)膜組織；HSF1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達，其陽性表達率與組織學(xué)分級相關(guān)（P＜0.001）、肌層浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與手術(shù)病理分期不相關(guān)；XAF1在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達，其陽性表達率與組織學(xué)分級、肌層浸潤、手術(shù)病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。在初步驗證了兩者在癌與非癌組織中的表達后，我們又在不同分化程度的癌組織中也進行了相關(guān)實驗，免疫組化染色實驗結(jié)果顯示：隨著癌組織分化水平的降低，HSF1基因

11、的表達呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，而XAF1基因的表達則呈現(xiàn)降低趨勢，以此結(jié)果我們設(shè)想它們很可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中分別參與并起到了一定的作用，為了能夠進一步的探尋其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過收集的完整病例資料進行了相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示兩者之間呈現(xiàn)出負相關(guān)關(guān)系（r=-0.582，P＜0.001）。
　　2.體外環(huán)境中，HSF1及XAF1在子宮內(nèi)膜癌三株細胞中的表達水平通過western blot實驗結(jié)果顯示：在這

12、三株細胞中，Ish-ikawa中HSF1表達水平最高，RL95-2次之，HEC-1A最低，而XAF1在Ish-ikawa中表達水平最低，RL95-2次之，HEC-1A最高，因此我們選取了RL95-2細胞作為慢病毒感染的對象，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定和真實性，在實驗條件下得到最準確的結(jié)果。
　　3.HSF1干涉實驗組Lv-sh-HSF1-RL95-2細胞中XAF1表達較對照組明顯增高；同時XAF1過表達實驗組Lv-XAF1-RL95-2

13、細胞中HSF1表達較對照組無明顯變化。
　　4.基于前期HSF1及XAF1負相關(guān)實驗結(jié)果以及成功構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系為基礎(chǔ)，課題組通過 MTT比色實驗繪制細胞生長曲線，在HSF1基因干涉組中實驗組Lv-sh-HSF1-RL95-2組細胞的增殖能力明顯降低，而對照組Lv-scramble-RL95-2，control細胞的增殖能力顯著高于實驗組（P＜0.05）。在XAF1基因過表達組中穩(wěn)定過表達XAF1的Lv- XAF1-RL95-2組

14、細胞增殖能力也相比較其他對照組顯著降低（P＜0.05）。
　　5.細胞周期檢測實驗結(jié)果顯示：實驗分組同上，在HSF1基因干涉組中實驗組與兩個對照組（Lv-scramble-RL95-2，control）相比較，實驗組（Lv-sh-HSF1-RL95-2）出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯，進入S期的細胞數(shù)量減少，干涉HSF1基因后子宮內(nèi)膜癌細胞 RL95-2出現(xiàn)了細胞周期阻滯。在XAF1基因過表達組中穩(wěn)定過表達XAF1的Lv-XAF1-RL9

15、5-2組細胞與Lv-cherry-RL95-2組和control組相比較，實驗組Lv-XAF1-RL95-2出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯，進入S期的細胞數(shù)量減少，穩(wěn)定過表達 XAF1基因可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細胞 RL95-2也同樣出現(xiàn)細胞周期阻滯。
　　6.細胞凋亡檢測實驗結(jié)果顯示：在XAF1基因過表達組中穩(wěn)定過表達XAF1的Lv-XAF1-RL95-2組與Lv-cherry-RL95-2組和control組相比較，實驗組Lv-XAF1-

16、RL95-2出現(xiàn)了明顯的早期凋亡趨勢（P＜0.001），這說明穩(wěn)定過表達 XAF1基因可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細胞RL95-2在早期就出現(xiàn)大量凋亡。在HSF1基因干涉組中，實驗組與兩個對照組（Lv-scramble-RL95-2，control）相比較，實驗組（Lv-sh-HSF1-RL95-2）出現(xiàn)了與過表達組相一致的結(jié)果（P＜0.001），實驗組細胞早期凋亡明顯增加，實驗說明干涉HSF1基因后子宮內(nèi)膜癌細胞RL95-2出現(xiàn)了細胞早期凋亡率

17、的增加。
　　結(jié)論：
　　HSF1及XAF1基因參與了多種人類相關(guān)疾病的進展過程，其中就包括腫瘤。在多種腫瘤中都有其對細胞增殖，周期和凋亡中發(fā)揮作用的研究。目前，這兩者在子宮內(nèi)膜癌中的相互關(guān)聯(lián)以及這種關(guān)聯(lián)在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用還尚未有明確報道。本課題組通過對兩者的表達以及表達所存在的關(guān)聯(lián)進行了分析，并通過體外實驗驗證了兩者在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其發(fā)生的機制，所有結(jié)果都提示在子宮內(nèi)膜癌中針對HSF1及XAF1基因為