HSF1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中拮抗氧化損傷作用的體外實驗研究.pdf

1、【背景】
　　子宮內(nèi)膜癌是對女性健康產(chǎn)生極大威脅的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率和病死率都呈現(xiàn)上升趨勢,儼然已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生難題,它作為嚴(yán)重危害女性健康的疾病已受到全世界的廣泛關(guān)注。美國2012年有47130名女性被診斷患有子宮內(nèi)膜癌并且有8010例因其死亡。在2004-2005年衛(wèi)生部惡性腫瘤回顧調(diào)查中,顯示子宮內(nèi)膜癌死亡率以約2.71/10萬高居女性惡性腫瘤死亡率第十位(2012中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒)。盡管多數(shù)子宮內(nèi)膜癌病例是

2、早期,但由于晚期以及低分化子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后極差,其5年生存率并不令人滿意,因此子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時治療顯得至關(guān)重要。
　　熱休克因子1(Heat shock factor1,HSF1)是調(diào)節(jié)細(xì)胞熱休克蛋白(HSPs)表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子,熱休克反應(yīng)被激活后HSF1能迅速改變HSP基因位點并增加它們的表達(dá),熱休克蛋白可以幫助錯誤折疊的多肽重新折疊并抑制蛋白聚合。這有利于細(xì)胞抑制蛋白應(yīng)激毒性和保持蛋白質(zhì)體內(nèi)平衡,使生物具有可感應(yīng)應(yīng)

3、力的分子機(jī)制來檢測和中和蛋白損傷。HSF1已經(jīng)通過細(xì)胞檢測、器官模型檢測、進(jìn)而包括酵母、線蟲、嚙齒目動物等生物水平的分析全面描述了它的功能。
　　盡管HSF1幫助細(xì)胞和有機(jī)體對抗嚴(yán)重有害刺激的作用已被廣泛研究并取得了一些研究結(jié)果,但仍然有許多問題亟待探討:HSF1對下游因子調(diào)控的功能是否參與腫瘤發(fā)生發(fā)展?HSF1對細(xì)胞的保護(hù)作用在其參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等多種關(guān)鍵的細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮著怎樣的作用?干預(yù)HS

4、F1后對這些細(xì)胞反應(yīng)又有何影響?
　　為了驗證HSF1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其作用,本實驗以不同濃度的過氧化氫分別作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株,觀察細(xì)胞的生存情況、HSF1的表達(dá)變化情況以及細(xì)胞受損傷狀況、抗氧化系統(tǒng)和線粒體功能改變情況,探討HSF1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株抗凋亡能力的影響及其作用機(jī)制,從而為以HSF1為子宮內(nèi)膜癌的治療靶點提供新的思路。
　　【研究目的】
　　1.探討HSF1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株的表達(dá)及其作用

5、>　　2.探討HSF1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株抗凋亡能力的影響及其作用機(jī)制
　　【研究方法】
　　1.應(yīng)用實時熒光定量PCR、Western blot技術(shù)檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中HSF1的表達(dá)水平。
　　2.應(yīng)用實時熒光定量PCR的方法檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞受到不同濃度過氧化氫刺激后HSF1的表達(dá)變化。
　　3.MTT法檢測細(xì)胞受到不同濃度過氧化氫刺激后的受抑制情況。
　　4.應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)HSF1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞

6、中的表達(dá),實時熒光定量PCR、Western blot技術(shù)檢測下調(diào)后HSF1表達(dá)水平的變化。
　　5.MTT法檢測下調(diào)HSF1后,各組細(xì)胞受到過氧化氫刺激時的受抑制情況。
　　6.Annexin V-PI雙染色法檢測下調(diào)HSF1前后,各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　7.使用流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)HSF1前后,各組細(xì)胞的周期變化。
　　8.使用酶標(biāo)儀檢測下調(diào)HSF1前后,各組細(xì)胞丙二醛含量、過氧化氫酶活性、谷胱甘肽含量、總抗

7、氧化能力以及ATP生成情況。
　　9.使用流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)HSF1前后,各組細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。
　　【實驗結(jié)果】
　　1.在Ishikawa細(xì)胞中HSF1的mRNA表達(dá)水平最高,HEC-1-B其次,RL95-2最低。
　　2.在Ishikawa細(xì)胞中HSF1的蛋白表達(dá)水平最高,HEC-1-B其次,RL95-2最低。Ishikawa細(xì)胞當(dāng)受到300μmol/L過氧化氫溶液刺激時HSF1表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上調(diào),刺激濃

8、度為500μmol/L時HSF1表達(dá)繼續(xù)增高,而在濃度到達(dá)700μmol/L時細(xì)胞內(nèi)HSF1的表達(dá)卻較500μmol/L略有降低,組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;HEC-1B細(xì)胞在受到300μmol/L過氧化氫刺激時HSF1表達(dá)出現(xiàn)明顯增高,而當(dāng)刺激濃度為500μmol/L時HSF1的表達(dá)出現(xiàn)降低,以700μmol/L濃度刺激時甚至低于基水平,組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;RL95-2細(xì)胞在50μmol/L低濃度過氧化氫刺激時HSF1表達(dá)即出現(xiàn)明顯上

9、升,當(dāng)濃度300μmol/L時HSF1表達(dá)與低濃度相比已有所降低,當(dāng)大于等于500μmol/L過氧化氫刺激時HSF1則出現(xiàn)了低于基水平的表達(dá),組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.Ishikawa細(xì)胞和HEC-1-B細(xì)胞分別在受到濃度為700μmol/L和500μmol/L的H2O2刺激后,細(xì)胞抑制率顯著增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義;而RL95-2細(xì)胞在受到300μmol/L的H2O2刺激后,細(xì)胞抑制率即出現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的明顯改變。

10、　　4.Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后HSF1的mRNA表達(dá)水平明顯降低,與空白組和陰性對照組存在顯著性差異(P<0.05),而陰性對照組與空白組無明顯組間差異(P>0.05)。
　　5.Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后HSF1的蛋白表達(dá)水平明顯降低,與空白組和陰性對照組存在顯著性差異(P<0.05),而陰性對照組與空白組無明顯組間差異(P>0.05)。
　　6.MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組Ishikawa細(xì)胞在受到H2O

11、2溶液刺激后細(xì)胞抑制率顯著增高且具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7.轉(zhuǎn)染siRNA后的Ishikawa細(xì)胞與空白對照組相比,在受到H2O2溶液刺激時G2+S期比例減少且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　8.轉(zhuǎn)染siRNA后的Ishikawa細(xì)胞在受到H2O2溶液刺激時,與對照組相比細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量明顯上升且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　9.正常狀態(tài)與應(yīng)激狀態(tài)下的Ishikawa細(xì)胞與對照組相比過氧化氫酶活性均

12、有所減弱且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　10.Ishikawa細(xì)胞與對照組相比總谷胱甘肽含量減少且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　11.轉(zhuǎn)染組Ishikawa細(xì)胞在受到H2O2溶液刺激時,與對照組相比總抗氧化能力減弱且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　12.轉(zhuǎn)染組Ishikawa細(xì)胞在受到H2O2溶液刺激時,與對照組相比ATP水平降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　13.

13、轉(zhuǎn)染siRNA后的Ishikawa細(xì)胞與對照組相比,在受到H2O2溶液刺激時活性氧含量明顯增高且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　【結(jié)論】
　　1.MTT結(jié)果與三株細(xì)胞內(nèi)HSF1基水平測定的結(jié)果呈現(xiàn)相關(guān)性,HSF1基水平最高的Ishikawa細(xì)胞抑制率>50％時的刺激濃度最高,為700μmol/L;HSF1基水平最低的RL95-2細(xì)胞出現(xiàn)抑制率>50%時的刺激濃度最低,為300μmol/L;而HSF1基水平介于兩者之

14、間的HEC-1-B細(xì)胞出現(xiàn)抑制率>50%時也處于500μmol/L的中間濃度。這提示HSF1的表達(dá)可能與腫瘤應(yīng)激能力相關(guān),促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。
　　2.下調(diào)HSF1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)后,一系列的檢測顯示HSF1與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抗凋亡能力相關(guān),HSF1可能是一種子宮內(nèi)膜腫瘤促進(jìn)因子,它被激活時增加了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞抗性,從而促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展。HSF1也許是一個較好的候選標(biāo)志物,有可能作為可利用的腫瘤病程干預(yù)潛在靶點。