RGS5在卵巢癌血管生成中的作用及意義.pdf

1、研究背景:
　　血管生成(angiogenesis)在維持卵巢生理功能和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用,提示抗腫瘤血管生成在抗腫瘤治療中具有重要的地位。目前抗VEGF及其受體的藥物在卵巢癌已進(jìn)入臨床應(yīng)用,取得了初期的療效,但對(duì)高級(jí)別的腫瘤單純使用抗VEGF藥物難以控制腫瘤的進(jìn)展,容易引起耐藥,甚至引發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。由于腫瘤的血管生成過(guò)程是一個(gè)有多種因素參與的,多條信號(hào)通路調(diào)控的,極其復(fù)雜的過(guò)程,單獨(dú)使用某種血管生成抑制因子或

2、是阻斷與血管生成相關(guān)的某一條信號(hào)通路并不能完全阻斷血管的生成,因而有必要尋找其他種類(lèi)的靶基因。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)介導(dǎo)的信號(hào)通路是細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑中最常見(jiàn)的一種信號(hào)傳遞方式,對(duì)機(jī)體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)都有著重要的影響。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)GPCRs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此對(duì) GPCRs通路的調(diào)控在腫瘤的病理生理過(guò)程具有重要意義。G蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白( Regulator of G P

3、rotein Signaling,RGS)是一類(lèi)負(fù)性調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路的蛋白分子,含有30多種蛋白質(zhì)。其中RGS5是G蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白家族中的一員,通過(guò)促進(jìn)G蛋白α亞基的GTP酶活性,負(fù)性調(diào)控GPCRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。RGS5高表達(dá)于腫瘤新生血管發(fā)育成熟的初期,調(diào)節(jié)血管周細(xì)胞的分化與募集,參與血管成熟的調(diào)控。RGS5在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(Tumor-derived microvascular endothelial cells, TdM

4、ECs)的表達(dá)明顯高于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞,其基因表達(dá)上調(diào)會(huì)明顯降低新生血管對(duì)于抗VEGF所致的血管退行性變的敏感性,表明RGS5可能是重要的替代貝伐珠單抗耐藥性的抗血管生成靶點(diǎn)。
　　研究目的:
　　抗腫瘤血管生成治療的耐藥性源于腫瘤血管的異質(zhì)性,包括染色體的不穩(wěn)定性,容易產(chǎn)生耐藥株,而了解TdMECs的異質(zhì)性,尋找特異而有效的靶點(diǎn),并通過(guò)組織來(lái)源不同的TdMECs作為藥物靶點(diǎn)的研究,可提高腫瘤抗血管生成藥物療效并降低耐藥性發(fā)

5、生率。RGS5可負(fù)性調(diào)節(jié)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的GPCRs信號(hào)通路,作為一個(gè)最近一兩年漸漸受到關(guān)注的蛋白,RGS5的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚,它不僅參與血管周細(xì)胞的成熟,在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞亦有高表達(dá)。目前RGS5在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道,了解RGS5在卵巢癌的表達(dá)特點(diǎn),研究其在卵巢癌血管生成中的作用及機(jī)制,將有利于多靶點(diǎn)抗血管生成的治療策略在卵巢癌的實(shí)施和發(fā)展。
　　研究方法:
　　1.回顧性分析87例卵巢癌組織標(biāo)

6、本,通過(guò)連續(xù)切片檢測(cè)RGS5在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)情況,分析RGS5與臨床各病理參數(shù)、患者生存時(shí)間以及微血管密度的關(guān)系。
　　2.在免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)獲得高純度卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells, ODMECs)形態(tài)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、體外成管以及生長(zhǎng)增值能力的觀(guān)察,了解ODMEC

7、s是否在體外培養(yǎng)中的生物學(xué)特性,并檢測(cè)RGS5的表達(dá)情況和特點(diǎn)。
　　3.通過(guò)構(gòu)建RGS5特異性siRNA慢病毒載體下調(diào)RGS5蛋白的表達(dá),了解RGS5參與調(diào)控的ODMECs體外生物學(xué)效應(yīng),并進(jìn)一步探討RGS5在卵巢癌血管生成中的作用及機(jī)制。
　　主要結(jié)果:
　　1. RGS5不僅在腫瘤血管周細(xì)胞表達(dá),在卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與Endoglin標(biāo)記的血管相重疊,但鮮見(jiàn)于CD34標(biāo)記的成熟血管,在一些無(wú)CD34也無(wú)

8、Endoglin表達(dá)的管腔樣結(jié)構(gòu)中亦偶見(jiàn)RGS5的陽(yáng)性著色。Endoglin是新生血管的標(biāo)記物,主要表達(dá)于卵巢癌邊緣的微血管,其表達(dá)水平與上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, ECO)血管生成密切相關(guān),提示RGS5可能參與了卵巢癌早期血管生成的調(diào)控。
　　2.第一次闡述了RGS5蛋白在卵巢癌細(xì)胞有表達(dá),其表達(dá)的高低與卵巢癌患者腹膜轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),高表達(dá)RGS5的患者腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯低于低表達(dá)RGS5

9、的患者,預(yù)后亦優(yōu)于后者。此外,RGS5在卵巢癌細(xì)胞的表達(dá)還與 CD34標(biāo)記的微血管密度(microvascular densities, MVD)呈負(fù)相關(guān)。
　　3.與正常內(nèi)皮細(xì)胞多處于靜止期不同,ODMECs增生活躍,胞核遺傳物質(zhì)豐富,高表達(dá)促血管生成因子VEGF、TGF-β的受體VEGFR2和Endoglin,體外成管能力增強(qiáng)。RGS5的表達(dá)在ODMECs體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成時(shí)降低,并且隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)遞減,推測(cè)可能與離開(kāi)腫

10、瘤微環(huán)境有關(guān),然而與 RGS5作用密切相關(guān)的 VEGF與PDGF-BB對(duì)其在體外的表達(dá)無(wú)明顯的刺激作用,說(shuō)明RGS5在腫瘤組織的表達(dá)可能不依賴(lài)于或不僅僅依賴(lài)于VEGFR和PDGF-β信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
　　4.缺氧可誘導(dǎo)RGS5在ODMECs表達(dá),通過(guò)慢病毒載體攜帶的RGS5特異性siRNA,實(shí)現(xiàn)對(duì)原代培養(yǎng)的ODMECs表達(dá)RGS5蛋白的高效抑制后發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下RGS5可抑制ODMECs細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期停滯于G1期到S期的轉(zhuǎn)化

11、節(jié)點(diǎn)。此外RGS5在ODMECs缺氧時(shí)還可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,但不影響細(xì)胞的遷移能力。
　　5.干擾RGS5蛋白的表達(dá)可使分裂周期蛋白CDC25A以及與細(xì)胞周期密切相關(guān)的CDK2蛋白和細(xì)胞周期蛋白CyclinE表達(dá)增高;MAPK通路中ERK磷酸化明顯降低。ERK1/2抑制劑PD98059可影響CDC25A、CDK2及CyclinE蛋白的表達(dá),其負(fù)性調(diào)節(jié)上述蛋白的表達(dá)與RGS5有協(xié)同效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),用PD98059與LV-siRG

12、S5同時(shí)處理ODMECs可明顯降低細(xì)胞的增殖率,提示RGS5可負(fù)性調(diào)節(jié)MAPK/ERK通路介導(dǎo)的CDC25A及下游蛋白CDK2和CyclinE的表達(dá),參與ODMECs細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)RGS5不僅在卵巢癌血管周細(xì)胞、在內(nèi)皮細(xì)胞亦有表達(dá),在癌細(xì)胞的表達(dá)則與腹膜轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后相關(guān),并且與微血管密度呈負(fù)相關(guān)。缺氧可誘導(dǎo) RGS5在ODMECs的表達(dá),從而抑制細(xì)胞的增殖。因此無(wú)論從內(nèi)皮細(xì)胞與血管周