黃芪多糖聯(lián)合丁酸鈉對K562細(xì)胞紅系分化及珠蛋白基因表達(dá)作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 β-地中海貧血(β-thalassemia，β-地貧)是一種常見的單基因遺傳病，是由于β-珠蛋白基因突變或缺失，使β-珠蛋白鏈合成障礙，導(dǎo)致相對過剩的α-肽鏈形成包涵體沉積于細(xì)胞膜上，引起紅細(xì)胞變形能力下降，在脾臟內(nèi)被大量破壞所致的一組遺傳性溶血性疾病。我國南方發(fā)病率較高，在造血干細(xì)胞移植尚難于廣泛推廣的情況下，藥物誘導(dǎo)基因治療已是臨床醫(yī)生及生物學(xué)家共同關(guān)注，致力研究的另一種方法。應(yīng)用藥物調(diào)控珠蛋白基因表達(dá)的

2、遺傳開關(guān)，激活非α珠蛋白基因的功能，增加非α珠蛋白的合成速率，或抑制α珠蛋白基因功能，降低α珠蛋白的合成速率，從而減輕α和非α珠蛋白的失平衡程度，甚至恢復(fù)α和β珠蛋白兩者比例的平衡，達(dá)到減輕臨床癥狀的目的。
　　 目前人們多致力于γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑的研究，它可以重新激活紅系細(xì)胞中已基本關(guān)閉的γ珠蛋白基因，合成γ鏈以替代缺陷的β珠蛋白鏈與相對過剩的α鏈構(gòu)成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，HbF)，降低α鏈與非α鏈之

3、間的不平衡。有研究發(fā)現(xiàn)部分γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑也能調(diào)節(jié)α、ξ、β、ε、δ珠蛋白基因表達(dá)，并影響α鏈與非α鏈的平衡。
　　 1982年國外首次報(bào)告應(yīng)用5-氮雜孢苷(5-azacytidine，5-AZAC)治療β-地貧取得較好療效，但其作用維持時(shí)間短，不良反應(yīng)大，有遠(yuǎn)期致癌性，限制了其在臨床的進(jìn)一步使用；隨后發(fā)現(xiàn)的羥基脲(Hydroxyurea，HU)在治療鐮狀細(xì)胞貧血方面效果甚佳，但治療β-地貧時(shí)至少有25％的患者無效，且長期應(yīng)用

4、易引發(fā)骨髓抑制；而丁酸鈉(Sodium butyrate，NaB)，雖然毒副作用較小，但其半衰期短，使用不便且費(fèi)用昂貴，諸多因素使這些藥物的臨床應(yīng)用受到一定限制；自八十年代至今二十年來已陸續(xù)有七十幾種藥物通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明是有效的γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑，由于部分誘導(dǎo)劑特異性差、毒性強(qiáng)等原因，進(jìn)入臨床使用的只有少數(shù)幾種，且只有HU通過美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)。因此迫切需要更有

5、效安全的新藥開發(fā)及新的治療策略來解決這些問題。新的化合藥物開發(fā)花費(fèi)大且耗時(shí)長，而具有中國傳統(tǒng)特色的天然中藥不良反應(yīng)輕微，藥源豐富，價(jià)格合適，具有良好的研究開發(fā)前景，已有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸根素、白藜蘆醇等天然提取物能有效上調(diào)γ珠蛋白基因表達(dá)，但尚未用于臨床。在新藥開發(fā)的同時(shí)，聯(lián)合用藥治療成為研究的另一方向，聯(lián)合藥物不同作用機(jī)制及靶點(diǎn)協(xié)同上調(diào)γ珠蛋白基因表達(dá)，并降低用藥劑量減輕細(xì)胞毒性成為治療的關(guān)鍵；已有較多學(xué)者對HU與NaB、HU與EPO等聯(lián)合

6、用藥進(jìn)行研究，證明聯(lián)合用藥能協(xié)同誘導(dǎo)HbF生成，但由于實(shí)驗(yàn)對象、基因型、用藥劑量、樣本量等多方面因素導(dǎo)致部分研究結(jié)果不一致，故臨床仍無統(tǒng)一治療標(biāo)準(zhǔn)。目前臨床常用γ基因誘導(dǎo)劑多為細(xì)胞毒類藥，藥物聯(lián)合雖然可降低用藥劑量減輕細(xì)胞毒性，但β-地貧的治療是一個(gè)長期的終生治療，其遠(yuǎn)期療效及毒副作用尚不確切，需繼續(xù)深入研究，尋找發(fā)現(xiàn)更有效、安全的治療方案。
　　 本課題組長期從事藥物誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)方面的研究，多致力于中藥類開發(fā)，并于05

7、年首次發(fā)現(xiàn)黃芪可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，并且增加γ珠蛋白基因表達(dá)和HbF合成；并進(jìn)一步研究證明APS是黃芪誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的有效成份，雖然其聯(lián)苯胺染色陽性率低于NaB單藥常規(guī)劑量，但由于藥物毒性低，聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞總數(shù)卻明顯高于NaB，且作用持續(xù)時(shí)間長，是一種有效的γ基因誘導(dǎo)劑，但其對其他珠蛋白基因的表達(dá)作用尚未明確。研究表明黃芪中最重要的天然有效成分黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS

8、)，具有刺激造血的作用，可以提高紅系集落形成單位(colony-forming unit-erythroid，CFU-E)和紅系爆式集落形成單位(burst formingunits-erythroid，BFU-E)的形成率，從而增加紅細(xì)胞數(shù)量與血紅蛋白量，并對放化療后所致骨髓造血功能的破壞有明顯的保護(hù)作用。結(jié)合APS作用持續(xù)長、低毒及骨髓保護(hù)等作用，將其與半衰期短、口服劑量大的細(xì)胞毒類誘導(dǎo)劑NaB聯(lián)合可能是新的選擇，能更有效誘導(dǎo)紅系分

9、化，調(diào)節(jié)γ及其他珠蛋白基因表達(dá)，減少用藥劑量，減輕細(xì)胞毒性。
　　 本研究旨在探討黃芪多糖聯(lián)合丁酸鈉對K562細(xì)胞紅系分化及七種珠蛋白基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用。以具有向紅系分化能力的人紅白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞為模型，首先通過臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測藥物對細(xì)胞的生長抑制率(inhibition rate)，及聯(lián)苯胺染色實(shí)驗(yàn)觀察藥物誘導(dǎo)細(xì)胞紅系分化后聯(lián)苯胺染色陽性率(Benzidine positive cells，BZ％)，選擇對

10、細(xì)胞生長抑制及紅系分化作用優(yōu)于NaB常規(guī)劑量組的最佳用藥劑量組合，然后用RT-PCR探討該組合對七種珠蛋白基因表達(dá)的作用。研究結(jié)果將為誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)的聯(lián)合用藥研究增添新的科學(xué)數(shù)據(jù)和研究思路，為臨床聯(lián)合用藥方案及實(shí)施提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1黃芪多糖聯(lián)合丁酸鈉作用K562細(xì)胞最佳濃度的選擇1.1不同濃度黃芪多糖、丁酸鈉分別對K562細(xì)胞生長抑制及紅系分化的影響1.1.1實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為2組，分別為黃芪多

11、糖單藥組(0～20mg/ml)；丁酸鈉單藥組(0～1000μmol/L)。
　　 1.1.2臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)：觀察藥物對細(xì)胞生長抑制的影響。細(xì)胞生長抑制率計(jì)算公式為：[(Cn-C0)-(Tn-T0)]/(Cn-C0)×100。C和T分別代表對照組和實(shí)驗(yàn)組每毫升細(xì)胞數(shù)，n和0為計(jì)數(shù)時(shí)的天數(shù)1.1.3聯(lián)苯胺染色實(shí)驗(yàn)：觀察藥物誘導(dǎo)K562紅系分化的程度。計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞數(shù)，聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞百分率=聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞數(shù)

12、/500×100％。
　　 1.2選擇聯(lián)合用藥最佳濃度1.2.1聯(lián)合用藥組濃度選擇標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)單個(gè)藥物抑制率、半數(shù)抑制濃度(IC50)及聯(lián)苯胺染色結(jié)果，選擇能誘導(dǎo)細(xì)胞紅系分化，IC50值上下的不同濃度聯(lián)合。
　　 1.2.2篩選最佳聯(lián)合用藥劑量：①觀察聯(lián)合用藥96小時(shí)細(xì)胞生長抑制率。q值判斷黃芪多糖與丁酸鈉聯(lián)合對細(xì)胞生長抑制的作用。q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，式中EA和EB為各藥單用抑制率，EAB為兩藥合用抑制

13、率。q>1.15為協(xié)同作用，0.85≤q≤1.15為相加作用，q<0.85為拮抗作用。
　　 ②聯(lián)合用藥誘導(dǎo)K562細(xì)胞96小時(shí)聯(lián)苯胺染色陽性率。
　　 2黃芪多糖、丁酸鈉單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞紅系分化及珠蛋白基因表達(dá)的作用2.1實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為5組，APS2.5mg/ml+NaB250μmol/L為實(shí)驗(yàn)組，APS2.5mg/ml、NaB250μmol/L為單藥低劑量組，NaB500μmol/L為常規(guī)劑量組，K5

14、62親本細(xì)胞為未用藥組。
　　 2.2聯(lián)苯胺染色觀察細(xì)胞紅系分化程度。
　　 2.3 RT-PCR分析APS與NaB聯(lián)合作用K562細(xì)胞對珠蛋白基因表達(dá)的影響。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，細(xì)胞生長抑制率、聯(lián)苯胺染色陽性率、各用藥組珠蛋白mRNA/未用藥組mRNA灰度比值比較采用析因分析；多組間均數(shù)比較采用One-way

15、 ANOVA，post hoc test方差齊性采用LSD法，方差不齊的采用DunnettT3法；P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1黃芪多糖聯(lián)合丁酸鈉作用K562細(xì)胞的最佳濃度1.1臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明：不同濃度APS、NaB對K562細(xì)胞生長均存在不同程度的抑制作用，抑制率隨著藥物濃度的降低而減輕，具有劑量依賴關(guān)系；隨著時(shí)間的延長而增加，具有時(shí)間依賴關(guān)系。
　　 1.2聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示

16、：不同濃度APS、NaB作用于K562細(xì)胞均能誘導(dǎo)紅系分化，其程度具有劑量時(shí)間相關(guān)性。
　　 1.3依據(jù)臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)及聯(lián)苯胺染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：APS與NaB聯(lián)合最佳組合有APS2.5mg+NaB100μM與APS2.5mg+NaB250μM兩組，其作用K562細(xì)胞96小時(shí)后聯(lián)苯胺染色細(xì)胞陽性率(BZ％)、細(xì)胞生長抑制率及細(xì)胞活力分別為(18.88±1.98)％、(46.24±2.97)％、(93±1.6)％和(35.59

17、±2.23)％、(67.47±3.76)％、(90±1.2)％，與單藥常規(guī)劑量組NaB500μM(16.27±1.09)％、(88.86±1.53)％、(74±2.4)％比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2黃芪多糖、丁酸鈉單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞紅系分化及珠蛋白基因表達(dá)的作用2.1黃芪多糖、丁酸鈉單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞紅系分化的作用聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示APS2.5mg、NaB250μM聯(lián)合用藥可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向

18、紅系分化，于48-144小時(shí)BZ％增高顯著，96小時(shí)達(dá)高峰BZ％為(32.89±0.24)％、，與常規(guī)劑量組NaB500μM(14.66±0.17)％比較增高有顯著意義(P<0.05)；與單藥低劑量組APS2.5mg(7.72±0.12)％、NaB250μM(7.58±1.46)％比較均增高有顯著性意義(P<0.05)。
　　 2.2黃芪多糖、丁酸鈉單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞珠蛋白基因表達(dá)的作用RT-PCR結(jié)果顯示，APS+N

19、aB能使γ珠蛋白基因表達(dá)上調(diào)，Gγ、Aγ-mRNA表達(dá)上調(diào)分別為2.40±0.02倍、1.61±0.01倍，與常規(guī)劑量組NaB500μM(2.08±0.02倍)、(1.31±0.02倍)比較有顯著性差異(P<0.05)；與單藥低劑量組APS2.5mg(1.25±0.01倍)、(1.19±0.02倍)、NaB250μM(1.26±0.01倍)、(1.18±0.01倍)比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 α-mRNA表達(dá)上調(diào)1

20、.16±0.02倍，與NaB500μM(1.14±0.02倍)比較無顯著性差異(P>0.05)；與APS2.5mg(1.07±0.04倍)、NaB250μM(1.02±0.13倍)比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 β-mRNA表達(dá)上調(diào)1.73±0.03倍，與NaB500μM(1.25±0.03倍)比較有顯著性差異(P<0.05)；與APS2.5mg(1.11±0.01倍)NaB250μM(1.16±0.02倍)比較有顯著

21、性差異(P<0.05)。
　　 ε-mRNA表達(dá)上調(diào)1.40±0.04倍，與NaB500μM(1.53±0.06倍)比較有顯著性差異(P<0.05)；與APS2.5mg(1.02±0.02倍)、NaB250μM(1.28±0.02倍)比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 ξ-mRNA表達(dá)上調(diào)1.18±0.03倍，與NaB500μM(1.16±0.03倍)及APS2.5mg(1.11±0.02倍)比較無顯著性差異(P>

22、0.05)；與NaB250μM(1.08±0.06倍)比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 δ-mRNA變化無顯著性差異，與各組比較均無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1首次為APS與NaB聯(lián)合用藥篩選到既有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化又減輕細(xì)胞毒性的最佳濃度組合方案：APS2.5mg+NaB100μM、APS2.5mg+NaB250μM。
　　 2首次實(shí)驗(yàn)證實(shí)APS+NaB能使K56

23、2細(xì)胞β簇基因Gγ、Aγ、β、ε-mRNA表達(dá)上調(diào)，尤其是Gγ、Aγ、β-mRNA；而δ-mRNA表達(dá)無顯著性變化；對α簇珠蛋白基因ξ、α-mRNA表達(dá)作用輕微。
　　 3首次實(shí)驗(yàn)證明APS+NaB低劑量聯(lián)合用藥比NaB常規(guī)劑量單用藥能更有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，增強(qiáng)γ珠蛋白基因表達(dá)上調(diào)，減輕細(xì)胞生長抑制及細(xì)胞毒性。
　　 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果為誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)的聯(lián)合用藥研究增加了新的科學(xué)依據(jù)及研究思路，為臨床聯(lián)合用藥新