黃芪多糖和丁酸鈉聯(lián)合用藥對人紅系細胞增殖和珠蛋白基因表達的作用.pdf

1、背景與目的：
　　 β-珠蛋白生成障礙性貧血(β-thalassemia，β-地貧)是常見的單基因遺傳病，是世界上發(fā)病率最高的遺傳性疾病之一。它的病理生理基礎是β-珠蛋白基因的突變或缺失，造成相對過剩的α-珠蛋白鏈聚合形成包涵體，使紅細胞生成減少、破壞過多而造成貧血。人類珠蛋白基因在個體發(fā)育的不同時間表現(xiàn)為階段特異性的表達與關閉，α-珠蛋白基因簇表現(xiàn)為ξ→α基因的轉換，而β-珠蛋白基因簇表現(xiàn)為ε→γ和γ→β基因的轉換。自上世紀8

2、0年代開始的藥物基因調控治療，目前已進入了臨床研究階段，并取得了較好的療效。γ-珠蛋白基因誘導劑的作用機制，是利用重新激活已近乎關閉的γ-珠蛋白基因表達，以改善α-和非α-珠蛋白鏈之間的不平衡，合成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，HbF)以彌補成人血紅蛋白(adult hemoglobin，HbA)的不足，最終達到減少溶血、緩解貧血癥狀的目的。由于此類藥物療效顯著，所以在這一研究方向上的探索具有特別重要的意義。
　

3、　 目前研究的γ-珠蛋白基因誘導劑主要有：羥基脲(hydroxyurea，HU)、5-氮胞核苷(5-azaeytidine，5-AZAC)、丁酸鹽類及其衍生物等。由于這些藥物存在骨髓抑制、潛在的致癌性、半衰期較短和價格昂貴等缺點，所以在臨床上的應用受到限制。因此，迫切需要發(fā)掘一些新的高效、低毒、價廉的γ-珠蛋白基因激活藥物以改善治療現(xiàn)狀。與西藥研制相比，中藥研發(fā)周期短，可解決西藥化合物人工合成難的問題，且療效和毒副作用較明確，具有良好

4、的研發(fā)前景。國內已有報道如益髓生血顆粒、黃根加味湯等中藥方劑可重新激活γ-珠蛋白基因表達。但由于地貧基因表型多樣，加上中藥方劑成分較多，有效部分難以評估，所以目前許多學者致力于篩選出單味中藥及其活性成分，如從一些抗腫瘤中藥中篩選出了甲異靛、三尖杉酯堿等成分，旨在評估其治療效果及作用機制。本課題組在前期實驗中從益氣補血、補腎升髓等中藥中篩選出了單味中藥黃芪，發(fā)現(xiàn)它可有效誘導K562細胞向紅系分化，并上調γ-珠蛋白基因表達。
　　

5、因西藥類γ-珠蛋白基因誘導劑的不良反應均存在不同程度的劑量依賴性，所以低劑量聯(lián)合用藥是一種值得研究的治療途徑，期望在減少藥物劑量的同時，又能利用各藥物作用靶點或機制的互補，使γ-珠蛋白基因表達增高。國外一些學者已在動物實驗或臨床研究中嘗試將丁酸鹽類與促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)或5-AZAC合用等，旨在探索不同的聯(lián)合用藥方式，發(fā)現(xiàn)某些藥物聯(lián)合應用可比單獨用藥更能顯著提高γ-珠蛋白基因表達的水平。但也有觀點認為，

6、某些聯(lián)合用藥反而增加細胞毒性，且對HbF合成的調節(jié)作用的結論尚不一致，有待進一步研究。
　　 西藥起效時間快，但作用時間不能持久且不良反應較大；中藥起效雖慢，但藥效維持時間較長且毒副作用較小。本課題組進一步研究證明：黃芪中起誘導γ-珠蛋白基因表達作用的有效成分主要是黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)，它不僅可誘導K562細胞向紅系分化，而且可增加γ-珠蛋白基因表達和HbF合成。與西藥丁酸鈉(

7、sodium butyrate，NaB)相比，它無明顯細胞生長抑制作用，且誘導持續(xù)的時間較長。已知APS具有廣泛的藥理作用，是很有價值的免疫增強劑，對靶器官有明顯的保護作用，可減輕放、化療后的骨髓抑制等不良反應。且其他研究也發(fā)現(xiàn)，APS有刺激骨髓造血、增強免疫功能及抗腫瘤的作用，對骨髓細胞有保護作用。能否將中西藥聯(lián)合應用，達到優(yōu)勢互補、減少劑量的效果，值得進一步探討。
　　 近年來國內外應用較廣泛的紅系細胞體外液體培養(yǎng)法是二步液

8、體培養(yǎng)法，用此方法建立的紅系細胞模型比K562細胞更能模擬人體內紅細胞的生成過程，體現(xiàn)個體發(fā)育中珠蛋白基因表達的轉換。
　　 本研究旨在探討APS和NaB單獨或聯(lián)合用藥對人紅系細胞增殖和珠蛋白基因表達的影響。實驗選用臍血來提取體外培養(yǎng)所需的造血干/祖細胞，并建立紅系細胞二步液體培養(yǎng)法。以使用該液體方法培養(yǎng)的紅系細胞為研究對象，觀察正常紅系細胞珠蛋白基因的表達規(guī)律，再進一步探討單獨或聯(lián)合用藥對珠蛋白基因表達的影響。并采用臺盼藍拒染

9、活細胞計數(shù)、形態(tài)學觀察和逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等方法對培養(yǎng)的紅系細胞進行觀察和分析，探討單獨或聯(lián)合用藥對細胞增殖、細胞形態(tài)和各珠蛋白基因mRNA的表達等方面的影響，而此研究結果將會為臨床聯(lián)合用藥新方案的設計和實施提供理論基礎。
　　 方法：
　　 1臍血來源：
　　 標本來自于廣州市南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院產

10、科健康產婦分娩胎兒臍帶，排除傳染性疾病、血液疾病、惡性腫瘤、各種嚴重妊娠并發(fā)癥等病例，用無菌采血袋(PCD-A抗凝)密閉式方法保存。
　　 2實驗分組：
　　 實驗分為6組，APS+NaB(2.5 mg/mL+250μmol/L)為低劑量聯(lián)藥組，APS2.5 mg/mL、NaB250μmol/L為低劑量單藥組，APS5.0mg/mL、NaB500μmol/L為常規(guī)劑量單藥組，空白對照組為未加藥組。
　　 3人紅系

11、細胞二步液體培養(yǎng)：
　　 從臍血中分離單個核細胞，分兩步在兩種不同的培養(yǎng)體系中進行人紅系細胞的體外液體培養(yǎng)。在研究正常紅系細胞在此液體培養(yǎng)過程中珠蛋白基因的表達規(guī)律時，分別在第二階段的第0、2、4、6、8、10、12和14天采樣；在研究單獨或聯(lián)合用藥對紅系細胞增殖和珠蛋白基因表達的作用時，在第二階段的第6天按所需終濃度加藥，然后分別在第8、10、12和14天采樣。
　　 4臺盼藍拒染活細胞計數(shù)，觀察人紅系細胞在培養(yǎng)過程中

12、不同時間點的增殖情況及藥物對細胞抑制率的影響。
　　 5 RT-PCR技術分析人紅系細胞7種珠蛋白基因(ξ，α，Gγ，Aγ，δ和β)在培養(yǎng)過程中不同時間點的表達情況。將各組與內參照表達量的值比較，得出相對光密度值；并以空白對照組表達量為1，計算其他組的表達倍數(shù)。
　　 6統(tǒng)計學方法：
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，不同時間點多組間的比較及固定濃度效應作時間因素

13、的單獨效應分析采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析，固定時間效應作濃度因素的單獨效應分析采用單向方差分析(One-Way ANOVA)，基于方差分析的多重比較如方差齊采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1體外液體培養(yǎng)人紅系細胞的增殖及珠蛋白基因表達的變化1.1細胞計數(shù)變化紅系細胞各時間點細胞增殖水平不同(F=655.682，P<0.001)。從第6天開始

14、細胞數(shù)呈指數(shù)上升，第10天后增殖速度逐漸減慢進入平臺期，至第12天達高峰(4.01±0.25)×106/ml(約為初始細胞數(shù)的4倍)。
　　 1.2各珠蛋白基因表達的變化α-珠蛋白基因簇：隨著紅系細胞的分化和成熟，α-mRNA的表達升高(F=19.845，P=0.046)，第14天達峰值0.96±0.12；ξ-mRNA只有少量表達，但不隨紅系細胞的成熟發(fā)生變化。
　　 β-珠蛋白基因簇：隨著紅系細胞的分化和成熟，β-mR

15、NA的表達升高(F=28.936，P=0.028)，第14天達峰值0.96±0.20；Gγ-和Aγ-mRNA的表達下降(F=48.923，P=0.016；F=19.353，P=0.042)，第14天分別達最低值0.45±0.05和0.37±0.08；ε-和δ-mRNA有少量表達，但不隨紅系細胞的成熟發(fā)生變化；γ-和β-mRNA表達的交叉轉換在第8～9天。
　　 2 APS和NaB單獨或聯(lián)合用藥對人紅系細胞增殖和珠蛋白基因表達的作

16、用2.1 APS和NaB單獨或聯(lián)合用藥對紅系細胞增殖的影響用藥后，各組的紅系細胞從第8天開始增殖減弱，第10天后逐漸達到一個穩(wěn)態(tài)，第12天APS+NaB聯(lián)藥組的細胞數(shù)(3.13±0.24)(×106/mL)大于NaB常規(guī)劑量組(2.88±0.19)(×106/mL)，小于APS常規(guī)劑量組(3.52±0.36)(×106/mL)。
　　 APS和NaB單獨或聯(lián)合用藥對紅系細胞均存在不同程度的抑制作用(F=18.616，P=0.00

17、0)。隨著藥物作用時間的延長，APS+NaB聯(lián)藥組抑制率的峰值(36.84±1.27)％小于NaB常規(guī)劑量組(44.55±2.83)％，大于APS常規(guī)劑量組(19.00±7.76)％(P<0.05)。
　　 2.2 APS和NaB單獨或聯(lián)合用藥對紅系細胞珠蛋白基因表達的影響APS+NaB低劑量聯(lián)合用藥后Gγ-mRNA水平上調的峰值為2.65±0.13倍(F=23.850，P=0.000)；大于APS和NaB常規(guī)劑量組(1.86±

18、0.13和1.85±0.33倍)，差異有顯著性(P<0.05)；亦明顯大于APS和NaB低劑量組(1.23±0.09和1.38±0.22倍)，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 APS+NaB低劑量聯(lián)合用藥后Aγ-mRNA水平上調的峰值為1.53±0.23倍(F=53.714，P=0.015)；與APS和NaB常規(guī)劑量組(1.48±0.07和1.35±0.12倍)比，差異無顯著性(P>0.05)；明顯大于APS和NaB低劑量組

19、(1.14±0.21和1.15±0.18倍)，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 APS和NaB單獨或聯(lián)合用藥后的不同時間點，各組的β-、ε-、δ-、α-和ξ-珠蛋白基因表達水平與未用藥組相比差異均無顯著性(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1成功建立了人紅系細胞體外二步液體培養(yǎng)方法，證實了使用該方法體外培養(yǎng)的紅系細胞能較好地模擬它在人體內的發(fā)育過程，為紅系細胞分化、成熟過程中珠蛋白基因表達轉換的研究提供了

20、良好模型。
　　 2首次在體外液體培養(yǎng)的人紅系細胞上證明，APS常規(guī)劑量單獨用藥可上調γ-珠蛋白基因的表達，尤其增加Gγ-mRNA的轉錄，且對細胞生長的抑制作用弱。對β-、ε-、和δ-珠蛋白基因等其他β-珠蛋白基因簇的表達無明顯影響，對α-和ξ-珠蛋白基因等α-珠蛋白基因簇的表達也無顯著作用。
　　 3首次在體外液體培養(yǎng)的人紅系細胞上證明，APS和NaB低劑量聯(lián)合用藥可上調γ-珠蛋白基因的表達，尤其增加Gγ-mRNA的轉

21、錄，且減輕了對細胞生長的抑制。對β-、ε-、和δ-珠蛋白基因等其他β-珠蛋白基因簇的表達無明顯影響，對α-和ξ-珠蛋白基因等α-珠蛋白基因簇的表達也無顯著作用。
　　 4首次在體外液體培養(yǎng)的人紅系細胞上證明，APS和NaB低劑量聯(lián)合用藥比APS及NaB常規(guī)劑量單獨用藥，能更有效誘導γ-珠蛋白基因的表達，且減輕細胞生長抑制及細胞毒性。
　　 5本實驗結果為誘導γ-珠蛋白基因表達的聯(lián)合用藥研究增加了新的科學依據(jù)及研究思路，為