丁酸鈉通過(guò)p38MAPK途徑誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)中轉(zhuǎn)錄因子的篩查及鑒定.pdf

1、背景與目的：珠蛋白生成障礙性貧血(thalassemia)是由于珠蛋白(globin)基因發(fā)生缺失或點(diǎn)突變等，使某種珠蛋白肽鏈合成受到抑制，導(dǎo)致珠蛋白肽鏈之間不平衡所引起的一組遺傳性溶血性貧血，是世界上發(fā)病率最高的單基因遺傳病，其中β-珠蛋白生成障礙性貧血在我國(guó)南方數(shù)省發(fā)病率較高。在珠蛋白生成障礙性貧血的治療上，輸血、離子螯合劑、骨髓移植和基因治療等治療方案雖然都有一定的療效，但又都存在不同的缺陷。目前倍受人們關(guān)注的γ-珠蛋白基因誘導(dǎo)劑

2、如丁酸鹽、羥基脲、促紅細(xì)胞生成素、曲古抑菌素A、地西他濱、氯化高鐵血紅素等可誘導(dǎo)出生后近乎關(guān)閉的γ-珠蛋白基因重新表達(dá)，合成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，HbF)(α2γ2)以代替成人血紅蛋白(adult hemoglobin，HbA)(α2β2)的不足，從而改善患者的臨床癥狀，但它們又面臨著自身的細(xì)胞毒性、遠(yuǎn)期致癌作用或半衰期較短等問(wèn)題。因此，迫切需要發(fā)掘一些新的激活γ-珠蛋白基因的藥物。
　　 發(fā)掘和設(shè)計(jì)更

3、合理新藥的前提是闡明藥物激活γ-珠蛋白基因重新表達(dá)的機(jī)制。雖然已經(jīng)報(bào)道了γ-珠蛋白基因誘導(dǎo)劑可通過(guò)活化p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等途徑誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因重新表達(dá)，但為什么p38MAPK信號(hào)途徑激活后可誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)尚不清楚。另外，Ikuta等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)丁酸鹽類藥物治療有效的病人γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)DNA序列與核蛋白的相互作用發(fā)生了改變，提示轉(zhuǎn)錄因子

4、在丁酸鹽類藥物對(duì)γ-珠蛋白基因激活中可能起重要作用，但哪些轉(zhuǎn)錄因子與γ-珠蛋白基因表達(dá)有關(guān)尚不清楚。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)和激活轉(zhuǎn)錄因子-2(activating transcription factor2，ATF-2)屬于ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是p38MAPK信號(hào)通路的下游調(diào)節(jié)因子，而丁酸鈉可以活化p38MAPK信號(hào)途徑并誘導(dǎo)Gγ-珠

5、蛋白基因的重新表達(dá)已有諸多報(bào)道；GATA結(jié)合蛋白-1/珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子-1(GATA binding protein-1/globin transcription factor-1，GATA-1)是GATA蛋白家族成員之一，GATA-1在造血干細(xì)胞(hematopoieticstem cells，HSCs)和多系祖細(xì)胞轉(zhuǎn)換點(diǎn)被激活，高水平的GATA-1活性是珠蛋白基因表達(dá)和紅細(xì)胞成熟所必需的。因此，深入闡明γ-珠蛋白基因誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)γ-珠蛋

6、白基因重新表達(dá)的分子機(jī)制，特別是探索CREB、ATF-2、GATA-1等轉(zhuǎn)錄因子的作用是十分必要的。
　　 基于以上研究結(jié)果和我們課題組以前的研究也證明了p38MAPK信號(hào)途徑中磷酸化的p38有直接的誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)的重要作用。本研究的目的是在建立選擇性p38持續(xù)高磷酸化、低磷酸化和各種對(duì)照K562細(xì)胞模型的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步分析不同狀態(tài)的K562細(xì)胞核蛋白與γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)特定DNA序列相互作用變化的差異，篩選并鑒定

7、與丁酸鈉通過(guò)p38MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。為深化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子在γ-珠蛋白基因激活中作用的認(rèn)識(shí)，闡明γ-珠蛋白基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)新藥提供新的分子靶點(diǎn)。
　　 方法：①細(xì)胞模型的建立和鑒定：選擇在多種誘導(dǎo)因素下具有向紅系分化能力的人紅白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞作為研究對(duì)象。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將pCDNA3.1質(zhì)粒、pCDNA3.1-MKK3(Glu)[含可選擇性持續(xù)激活p38的絲裂原

8、活化蛋白激酶激酶-3(mitogen-activated protein kinase kinase-3，MKK3)突變體MKK3(Glu)]和pCDNA3.1-MKK3(Ala)[含可選擇性使p38低磷酸化的MKK3突變體MKK3(Ala)]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，G418篩選抗性克隆，采用PCR、RT-PCR和Western blotting等方法檢測(cè)目的基因的整合和表達(dá)、p38的表達(dá)和磷酸化水平，建立選擇性p38持續(xù)高磷酸化和低

9、磷酸化的細(xì)胞模型[分別稱為K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562-MKK3(Ala)細(xì)胞)]及轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞模型K562-vect細(xì)胞。參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)和我們以往研究的經(jīng)驗(yàn)，選擇用0.5mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)72h的K562細(xì)胞作為藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞模型(丁酸鈉+K562細(xì)胞)；選擇100μmol/L羥基脲誘導(dǎo)72h的K562細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞模型(羥基脲+K562細(xì)胞)。同時(shí)設(shè)立K562親本細(xì)胞、p38特異抑制劑S

10、B203580(10μmol/L)處理1h后0.5mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)72h的K562細(xì)胞(SB+丁酸鈉+K562細(xì)胞)和SB203580(10μmol/L)處理1h的K562-MKK3(Glu)細(xì)胞(SB+K562-MKK3(Glu)細(xì)胞)作為陰性對(duì)照細(xì)胞模型。采用RT-PCR、Westernbotting和聯(lián)苯胺染色等方法對(duì)不同狀態(tài)的K562細(xì)胞模型中p38的表達(dá)和磷酸化水平、γ-珠蛋白基因和胎兒血紅蛋白的表達(dá)及聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞

11、進(jìn)行鑒定。②不同狀態(tài)的K562細(xì)胞對(duì)外源性Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子活性的影響：登錄轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)資料庫(kù)(Database of Transcriptional Start Site，DBTSS)網(wǎng)站(http：//dbtss.hgc.jp/index.html)查找Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子序列。利用分子克隆技術(shù)，克隆Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子序列(-1350～+36)并構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒pGL3-Gγ，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入不同狀態(tài)的K

12、562細(xì)胞，以含人單純皰疹病毒胸苷激酶(human simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)啟動(dòng)子并可表達(dá)海腎熒光素酶(Renilla luciferase)的phRG-TK質(zhì)粒為內(nèi)對(duì)照，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測(cè)不同狀態(tài)的K562細(xì)胞對(duì)外源性Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子活性的影響。③EMSA探針的設(shè)計(jì)與合成：選取Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)富集

13、區(qū)寡核苷酸序列作為電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)探針序列，生物素標(biāo)記的雙鏈DNA探針和同序未標(biāo)記的雙鏈DNA探針均由美國(guó)集成DNA技術(shù)(IntegratedDNA Technologies，IDT)公司合成。④轉(zhuǎn)錄因子的篩選、鑒定：提取不同狀態(tài)細(xì)胞模型核蛋白并定量后，通過(guò)EMSA、super-EMSA等方法篩選鑒定K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和丁酸鈉誘導(dǎo)的K5

14、62細(xì)胞中與Gγ-珠蛋白基因表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。提取不同狀態(tài)細(xì)胞模型總蛋白并定量后，通過(guò)Western blotting進(jìn)一步驗(yàn)證有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和磷酸化水平。
　　 結(jié)果：①轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型的建立：以脂質(zhì)體介導(dǎo)將pCDNA3.1、pCDNA3.1-MKKa(Glu)和pCDNA3.1-MKKa(Ala)真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，PCR、RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示：含目的基因的質(zhì)粒DNA已經(jīng)

15、穩(wěn)定整合入K562細(xì)胞基因組中。與K562親本細(xì)胞和K562-vect細(xì)胞相比，K562-MKK3(Glu)細(xì)胞(F=439.816，P=0.000<0.01)和K562-MKK3(Ala)細(xì)胞(F=583.734，P=0.000<0.01)中均穩(wěn)定高表達(dá)MKK3；盡管K562-MKKa(Glu)細(xì)胞和K562-MKK3(Ala)細(xì)胞中p38在mRNA和蛋白水平表達(dá)沒(méi)有明顯變化，但K562-MKK3(Glu)細(xì)胞中p38磷酸化水平顯著升

16、高(約為K562-vect細(xì)胞的4.5倍；F=1284.587，P=0.000<0.01)，而K562-MKK3(Ala)細(xì)胞中p38磷酸化水平降低(約為K562-vect細(xì)胞的0.7倍；F=1129.629，P=0.000<0.01)。SB+K562-MKK3(Glu)細(xì)胞中p38的磷酸化又降低至K562親本細(xì)胞水平。建立了選擇性p38持續(xù)高磷酸化和低磷酸化的細(xì)胞模型(分別稱為K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562-MKK3(Al

17、a)細(xì)胞)及轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞模型K562-vect細(xì)胞。②藥物誘導(dǎo)細(xì)胞模型的建立：參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)和我們以往研究的經(jīng)驗(yàn)，選擇0.5mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)72h的K562細(xì)胞(丁酸鈉+K562細(xì)胞)作為藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞模型；選擇100μmol/L羥基脲誘導(dǎo)72h的K562細(xì)胞(羥基脲+K562細(xì)胞)作為陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞模型。結(jié)果顯示：與K562親本細(xì)胞相比，丁酸鈉+K562細(xì)胞和羥基脲+K562細(xì)胞中p38在mRNA和蛋白水平表

18、達(dá)沒(méi)有明顯變化，但丁酸鈉+K562細(xì)胞和羥基脲+K562細(xì)胞中p38磷酸化水平顯著升高(分別約為K562親本細(xì)胞的4.2和3.9倍；F=4782.087，P=0.000<0.01)，而SB+丁酸鈉+K562細(xì)胞中p38磷酸化又重新降低至K562親本細(xì)胞水平。成功建立了藥物(丁酸鈉和羥基脲)誘導(dǎo)的p38高磷酸化的細(xì)胞模型。③不同狀態(tài)K562細(xì)胞模型的進(jìn)一步鑒定：RT-PCR、Western blotting和聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示：與K562

19、親本細(xì)胞和K562-vect細(xì)胞相比，K562-MKK3(Glu)細(xì)胞、丁酸鈉+K562細(xì)胞和羥基脲+K562細(xì)胞中Gγ-珠蛋白(分別約為K562-vect細(xì)胞或K562親本細(xì)胞的1.4、1.4和1.5倍；F=1815.733，P=0.000<0.01)和胎兒血紅蛋白表達(dá)(分別約為K562-vect細(xì)胞或K562親本細(xì)胞的3.5、3.4和3.5倍；F=9164.470，P=0.000<0.01)及聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞(分別約為K562-v

20、ect細(xì)胞或K562親本細(xì)胞的10.5、11.3和10.5倍；F=3624.630，P=0.000<0.01)顯著增加，K562-MKK3(Ala)細(xì)胞中Gγ-珠蛋白(約為K562-vect細(xì)胞的0.8倍；P=0.000<0.01)和胎兒血紅蛋白表達(dá)(約為K562-vect細(xì)胞的0.4倍；P=0.000<0.01)及聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞(約為K562-vect細(xì)胞的0.6倍；P=0.000<0.01)降低。SB+K562-MKK3(Glu

21、)細(xì)胞中Gγ-珠蛋白和胎兒血紅蛋白表達(dá)及聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞均又重新降低，基本恢復(fù)至K562親本細(xì)胞水平(抑制率分別為：102.12％、100.48％和84.35％)；而SB+丁酸鈉+K562細(xì)胞中Gγ-珠蛋白和胎兒血紅蛋白表達(dá)及聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞也均有明顯較降低(抑制率分別為：56.43％、60.94％和71.3％)，即仍維持較高水平。這些細(xì)胞膜型的建立為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。④不同狀態(tài)K562細(xì)胞對(duì)外源性Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子活性的影響

22、：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：與K562親本細(xì)胞和K562-vect細(xì)胞相比，K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和丁酸鈉+K562細(xì)胞中熒光素酶活性顯著增加(相對(duì)活性分別約為K562-vect細(xì)胞或K562親本細(xì)胞的2.4和2.8倍；F=546.211，P=0.000<0.01)，而K562-MKK3(Ala)細(xì)胞中熒光素酶活性降低(相對(duì)活性約為K562-vecr細(xì)胞的0.7倍；P=0.000<0.01)。在K562-MKK3(Glu)

23、細(xì)胞中熒光素酶活性可被p38特異抑制劑SB203580抑制(抑制率為：99.32％)，而在丁酸鈉+K562細(xì)胞中p38特異抑制劑SB203580僅部分抑制熒光素酶活性(抑制率為：59.59％；P=0.000<0.01)。說(shuō)明不同狀態(tài)的K562細(xì)胞激活外源性Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子能力不同。⑤轉(zhuǎn)錄因子的篩選和鑒定：EMSA和super-EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在丁酸鈉通過(guò)p38MAPK途徑誘導(dǎo)Gγ-珠蛋白基因表達(dá)中CREB、ATF-2和GAT

24、A-1可與Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)特異DNA序列相結(jié)合，其中CREB和ATF-2與Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)特異DNA序列的結(jié)合可被p38特異抑制劑SB203580抑制，而p38特異抑制劑SB203580不能完全抑制GATA-1與Gγ-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)特異DNA序列的結(jié)合。Western blotting結(jié)果顯示：不同狀態(tài)K562細(xì)胞模型中總CREB(F=0.687，P=0.663>0.05)和ATF-2(F=0.832，P=0.564

25、>0.05)表達(dá)沒(méi)有變化，但在K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和丁酸鈉+K562細(xì)胞中CREB(分別約為K562-vect細(xì)胞或K562親本細(xì)胞的3.4和3.2倍；F=4051.126，P=0.000<0.01)和ATF-2(分別約為K562-vect細(xì)胞或K562親本細(xì)胞的2.5和2.9倍；F=5721.138，P=0.000<0.01)磷酸化水平顯著增加，并且可被p38特異抑制劑SB203580抑制。丁酸鈉+K562細(xì)胞中總GATA

26、-1的表達(dá)水平顯著高于其它細(xì)胞模型(約為K562親本細(xì)胞的1.9倍；F=7024.656，P=0.000<0.01)，K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和丁酸鈉+K562細(xì)胞中GATA-1磷酸化水平顯著增加(分別約為K562-vect細(xì)胞或K562親本細(xì)胞的3.9和5.1倍；F=4028.713，P=0.000<0.01)，但K562-MKK3(Glu)細(xì)胞中GATA-1磷酸化可被p38特異抑制劑SB203580抑制(抑制率為：99.58

27、％)，而在丁酸鈉+K562細(xì)胞中p38特異抑制劑SB203580僅部分抑制GATA-1磷酸化(抑制率為：62.17％；P=0.000<0.01)。與K562親本細(xì)胞和K562-vect細(xì)胞相比，K562-MKK3(Ala)細(xì)胞中CREB、ATF-2和GATA-1磷酸化水平均顯著降低(分別約為K562-vect細(xì)胞的0.2、0.6和0.5倍；P=0.000<0.01)。
　　 結(jié)論：①成功建立了 p38持續(xù)高磷酸化和低磷酸化的K5

28、62細(xì)胞模型，進(jìn)一步證實(shí)了p38MAPK信號(hào)途徑的激活在藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因重新表達(dá)中起重要作用。②首次證明了丁酸鈉通過(guò)p38MAPK誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)時(shí)核蛋白與γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)特定DNA序列相互作用增強(qiáng)。③首次揭示了丁酸鈉通過(guò)p38MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子有CREB、ATF-2和GATA-1。這些轉(zhuǎn)錄因子在丁酸鈉通過(guò)p38MAPK信號(hào)途徑激活γ-珠蛋白基因重新表達(dá)中起重要作用。④轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型結(jié)

29、果提示通過(guò)p38MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因重新表達(dá)中CREB、ATF-2和GATA1的活化與p38MAPK途徑的激活密切相關(guān)。⑤丁酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞模型結(jié)果提示丁酸鈉通過(guò)p38MAPK信號(hào)途徑激活γ-珠蛋白基因重新表達(dá)中CREB和ATF-2的活化與p38MAPK途徑的激活密切相關(guān)；GATA-1的活化除與p38MAPK途徑的激活有關(guān)外，可能還涉及到其它的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。⑥本研究結(jié)果為闡明γ-珠蛋白基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的