槲皮素聯(lián)合丁酸鈉或IP-10對人食管癌EC9706細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的
　　 食管癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多階段、多途徑共同作用的結(jié)果，但是其確切機(jī)制至今尚不完全清楚。槲皮素(quercetin)是具有多種生物活性的植物類黃酮的最有效成分之一。國內(nèi)外關(guān)于槲皮素生物學(xué)作用的研究很多，它具有抗腫瘤、抗炎癥、抗過敏等生物學(xué)功能。丁酸鈉(sodium butyrate，SB)是一種短鏈脂肪酸類的組蛋白脫乙酰化酶抑制物，是人體最基本的生理性去乙?；敢种埔蜃印１姸嘌芯孔C實，SB對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、

2、誘導(dǎo)分化和促進(jìn)凋亡的作用。本研究擬應(yīng)用納米脂質(zhì)體槲皮素(nanoliposomal quercetin，nLQ)和SB，觀察其單獨和聯(lián)合用藥分別對人食管癌EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響，對抑癌基因p16、p21walfl的表達(dá)的影響以及對DNMT1，HDAC1，NF-κB，Cyclin D1，Caspase3和E-cadherin表達(dá)的調(diào)節(jié)。旨在探討nLQ和SB在人食管癌EC9706細(xì)胞增殖和凋亡中相互作用及其作用機(jī)理。
　　

3、 IP-10是干擾素-γ（IFN-γ）誘導(dǎo)產(chǎn)生的分子量為10KDa的蛋白質(zhì)，具有前炎癥因子(pro-inflammatory factor)和趨化因子(chemokine)的效應(yīng)。有研究證實，IP-10不但吸引炎癥細(xì)胞趨向病灶，而且尚可促進(jìn)角朊細(xì)胞增生。本研究檢測nLQ和IP-10單獨和聯(lián)合作用后對人食管癌EC9706細(xì)胞增殖的影響，以初步揭示nLQ和IP-10在人食管癌EC9706細(xì)胞增殖中相互作用及其作用機(jī)制。
　　 方法<

4、br>　　 1．MTT方法檢測細(xì)胞增殖的抑制率
　　 (1)檢測nLQ和SB單獨、聯(lián)合應(yīng)用對EC9706細(xì)胞增殖的影響
　　 實驗設(shè)4組：nLQ組(20μmol/L，40μmol/L，60μmol/L);SB組(1mmol/L，2mmol/L，4mmol/L)；聯(lián)合藥物組(40μmol/LnLQ+2mmol/LSB);不加藥物的空白對照（Control）組。各組細(xì)胞培養(yǎng)48h。
　　 (2)檢測nLQ和IP-1

5、0單獨、聯(lián)合應(yīng)用對EC9706細(xì)胞增殖的影響
　　 實驗設(shè)4組：nLQ組(20μmol/L，40μmol/L，60μmol/L);IP-10組（10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）；聯(lián)合藥物組(40μmol/LnLQ+20ng/mlIP-10);不加藥物的空白對照（Control）組。各組細(xì)胞培養(yǎng)48h。
　　 2．細(xì)胞凋亡(TUNEL)檢測
　　 實驗分四組，nLQ組(40μmol/L)、SB組(2

6、mmol/L)、聯(lián)合組(40μmol/LnLQ+2mmol/LSB)及不加藥物的空白對照(Control)組。4％多聚甲醛固定各組細(xì)胞標(biāo)本，5μg/ml蛋白酶K37℃消化8min，4％多聚甲醛后固定5min，各標(biāo)本加TdT孵育液（0.6μlTdT，0.6μlbiotion-16-dUTP，16μlTdT緩沖液）共17.2μl，4℃濕盒過夜。次日加pH7.5的Tris-Cl1∶500稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-AP)，37℃孵育

7、20min，BCIP/NBT顯色，37℃孵育30min，鏡下觀察，水洗終止反應(yīng)。同時設(shè)以PBS代替TdT孵育液的陰性對照。
　　 3．免疫細(xì)胞化學(xué)單染或雙染色
　　 (1)標(biāo)本分兩大組
　　 ①．nLQ和SB處理組：實驗分4小組，nLQ組(40μmol/L)、SB組(2mmol/L)、聯(lián)合組(40μmol/LnLQ+2mmol/LSB)和對照（Control）組。
　　 ②．nLQ與IP-10組：實驗分4

8、小組，nLQ組(40μmol/L)、IP-10組(20ng/ml)、聯(lián)合組(40μmol/LnLQ+20ng/mlIP-10)和對照（Control）組。
　　 (2)免疫細(xì)胞化學(xué)雙染色
　　 各組細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛常規(guī)固定、吹干及Triton X-100透化處理，用0.3％H2O2和5mM左旋咪唑先后處理以抑制內(nèi)源性過氧化物酶（HRP）和內(nèi)源性堿性磷酸酶(AP)，熱修復(fù)5min，以正常山羊血清封閉，加一抗工作液：p

9、16單抗與DNMT1多抗，p16單抗與HDAC1多抗，p21walfl單抗與DNMT1多抗，p21walfl單抗與HDAC1多抗，4℃過夜。次日以HRP-抗小鼠IgG37℃孵育30min，DAB底物顯棕色，洗標(biāo)本后再加AP-抗兔IgG或HRP-抗羊IgG，37℃孵育30min，AP底物的NBT-BCIP顯藍(lán)色或HRP的底物AEC顯紅色。同時進(jìn)行PBS代替一抗的空白對照處理。
　　 ①．nLQ、SB單獨和聯(lián)合處理的細(xì)胞標(biāo)本

10、　　 常規(guī)固定、吹干及透化，應(yīng)用SP試劑盒，檢測NF-κB，CyclinD1，E-cadherin及Caspase3的表達(dá)。同時進(jìn)行PBS代替一抗的空白對照處理。
　　 ②．nLQ、IP-10單獨和聯(lián)合處理的細(xì)胞標(biāo)本
　　 常規(guī)固定、吹干及透化，應(yīng)用SP試劑盒，檢測NF-κB及CyclinD1的表達(dá)。同時做PBS代替一抗的空白對照處理。
　　 對于nLQ、SB單獨和聯(lián)合處理的細(xì)胞，nLQ、IP-10單獨和聯(lián)合處

11、理的細(xì)胞，分別用CellyticM提取總蛋白質(zhì)，檢測蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，對DNMT1，NF-κB，HDAC1，CyclinD1，p21walfl和p16（以β-Actin作為內(nèi)參照）進(jìn)行免疫印跡定性及半定量檢測。
　　 5．統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SSPS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對各組細(xì)胞標(biāo)本免疫化學(xué)雙染信號計數(shù)的比值，以卡方檢驗進(jìn)行分析，各組間比較時以α=0.0083為顯著性水準(zhǔn)；應(yīng)用圖像分析儀

12、掃描各免疫細(xì)胞化學(xué)單染色信號和免疫印跡圖像條帶的灰度值，各印跡信號數(shù)值為各主帶掃描灰度值與各β-Actin掃描灰度值的比值，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，以單因素方差分析進(jìn)行比較，α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果
　　 1．MTT實驗
　　 (1)nLQ及SB對EC9706細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)抑制效應(yīng)，且抑制呈劑量依賴性，各組間皆有顯著性差異(P＜0.01)。且聯(lián)合組與單40μmol/LnLQ或

13、單2mmol/LSB組相比作用更強(qiáng)(P＜0.01)。
　　 (2)IP-10對EC9706細(xì)胞呈現(xiàn)促增殖的劑量依賴性(P＜0.01)，nLQ拮抗IP-10的促生長作用，但聯(lián)合組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 2．凋亡檢測(TUNEL)
　　 人食管癌EC9706細(xì)胞中，TUNEL凋亡信號呈藍(lán)紫色，凋亡細(xì)胞中發(fā)生胞核固縮，或呈新月狀位于細(xì)胞周緣，部分凋亡細(xì)胞尚可見凋亡小體。C組，nLQ組，S

14、B組和nLQ+SB組細(xì)胞凋亡率分別為4.3％，23.6％，22.3％，43.8％。與對照組相比，nLQ組，SB組和聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且聯(lián)合組與nLQ組或SB組相比差異顯著（P＜0.01）。
　　 3．免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果
　　 (1)nLQ和SB處理的細(xì)胞
　　 ①．與對照組相比，各藥物組p16和p21walfl表達(dá)的棕色信號均增強(qiáng)，DNMT1/HDAC1表達(dá)的藍(lán)色/紅色信號均

15、減弱(P＜0.0083);且聯(lián)合藥物組比單nLQ和單SB組效應(yīng)均顯著(P＜0.0083)。
　　 ②.與對照組相比，各藥物組的E-cadherin和Caspase3的免疫反應(yīng)性（immunohistochemical reactivity, IR）信號增強(qiáng)，CyclinD1和NF-κB的IR信號減弱(P＜0.01)；且聯(lián)合藥物組比各單藥物組效應(yīng)更顯著(P＜0.01)。
　　 (2)nLQ與IP-10處理的細(xì)胞
　　

16、 ①.與對照組相比，單nLQ組p16和p21walfl表達(dá)的棕色信號均增強(qiáng)，DNMT1和HDAC1表達(dá)均的藍(lán)色/紅色信號減弱(P＜0.0083)，單IP-10組的p16和p21walfl表達(dá)均減弱，DNMT1和HDAC1表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.0083)。nLQ+IP-10組與單IP-10組相比差異顯著(P＜0.0083)。
　　 ②.與對照組相比，nLQ組細(xì)胞的NF-κB和CyclinD1的IR信號均減弱，（P＜0.01），而I

17、P-10組的IR信號均增強(qiáng)(P＜0.01)。nLQ+IP-10組與單IP-10組相比差異顯著(P＜0.01）。
　　 4．免疫印跡
　　 (1)nLQ和SB處理組：與對照組相比，各藥物組HDAC1，NF-κB，CyclinD1的印跡信號減弱，p21walfl和p16的免疫印跡信號增強(qiáng)，差異均顯著（P＜0.01）；且聯(lián)合加藥組與單加藥組之間比較差異亦顯著（P＜0.01）；關(guān)于DNMT1的印跡信號，nLQ組和聯(lián)合組的均減弱（

18、P＜0.01），SB組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 (2)nLQ與IP-10處理組：與對照組相比，IP-10組HDAC1，NF-κB，Cyclin D1的印跡信號增強(qiáng)，p21walfl和p16的印跡信號減弱（P＜0.01）；nLQ組HDAC1，`NF-κB，CyclinD1的印跡信號減弱，p21walfl和p16的印跡信號增強(qiáng)（P＜0.01）。DNMT1的印跡信號，IP-10組的差異不顯著（P＞0.05），nLQ組

19、的減弱有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。且IP-10組與聯(lián)合藥物組組之間比較差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 結(jié)論
　　 1．nLQ和SB單獨和聯(lián)合應(yīng)用對人食管癌EC9706細(xì)胞增殖均有抑制作用，且二者聯(lián)合抑制作用更顯著。二者均可通過下調(diào)DNMT1和HDAC1的活性而上調(diào)抑癌基因p16、p21walfl的表達(dá)；還可下調(diào)NF-κB，CyclinD1，上調(diào)E-cadherin、Caspase3的表達(dá)；提示兩者通過上述