PDK1siRNA及UCN-01對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞PDK1基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、我國食管癌發(fā)病率位居世界首位，開發(fā)新型藥物、分子靶向治療食管癌成為研究的熱點(diǎn)。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent proteinkinase1，PDK1)屬于AGC激酶家族，其介導(dǎo)調(diào)節(jié)的PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PDK1是Akt、p70-S6K、RSK、PKC等AGC激酶活化環(huán)的主要上游激酶，作為Akt上游激酶，1997年被A1essi DR等分

2、離鑒定，可以磷酸化Akt的Thr308位點(diǎn)使其激活，活化的Akt調(diào)節(jié)其下游的多條路徑，繼而影響糖類代謝、蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞增殖、遷移以及抗凋亡。PDK1可能成為當(dāng)前腫瘤治療研究中新的靶點(diǎn)。
　　 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象，具有高效、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因功能鑒定、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等研究領(lǐng)域，同時(shí)也為多種疾病特別是惡性腫瘤的基因治療開拓了新的思路。UCN-0

3、1(7-hydroxy staurosporine)是目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道中研究較成熟的PDK1抑制劑，是星孢菌素(staurosporine)的7α羥基衍生物。UCN-01能通過競爭性抑制PDK1的ATP結(jié)合位點(diǎn)而抑制其激酶活性，從而使下游Akt磷酸化水平下降，干擾下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而影響細(xì)胞代謝、增殖和凋亡，引起細(xì)胞毒作用。本研究采用PDK1 siRNA及其抑制劑UCN-01沉默食管癌EC9706細(xì)胞中PDK1基因，阻斷P13K/Akt信

4、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，觀察下游Akt蛋白磷酸化水平的變化，及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為尋求食管癌的分子靶向治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　 1．高分化人食管鱗癌EC9706細(xì)胞株于37℃、5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，以RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)PDK1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或以50nM、100nM、200nM濃度的UCN-01分別作用于細(xì)胞24h、48h、72h。
　　 2．采用RT-PCR技術(shù)檢測各組細(xì)

5、胞中PDK1 mRNA的表達(dá)。
　　 3．采用Western Blot技術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞中PDK1、Akt、p-Akt的蛋白表達(dá)。
　　 4．采用MTT法檢測各組細(xì)胞生長抑制率。
　　 5．采用TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡的變化情況。
　　 6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1．siRNA轉(zhuǎn)染效率檢

6、驗(yàn)：不同濃度Negative control FAM-siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，6h后在熒光顯微鏡下觀察，濃度100nM組轉(zhuǎn)染效率最高，后續(xù)siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均采用此濃度。
　　 2．PDK1 siRNA的篩選：與細(xì)胞對(duì)照組相比，Negative control siRNA組和RNAi-Mate組對(duì)PDK1 mRNA表達(dá)沒有影響，且二者之間無明顯差異（P＞0.05）。三條PDK1 siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞的PDK1

7、mRNA水平均低于細(xì)胞對(duì)照組(．P＜0.05)，其中PDK1 siRNA1抑制效率最高(P＜0.05)，篩選出PDK1 siRNA1序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　 3．PDK1 siRNA、UCN-01對(duì)PDK1 mRNA表達(dá)的影響：PDK1 siRNA1轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞可下調(diào)PDK1 mRNA表達(dá)，以轉(zhuǎn)染72h較顯著(P＜0.05); UCN-01也能夠下調(diào)EC9706細(xì)胞PDK1 mRNA表達(dá)，且具有濃度依賴性和作用時(shí)間依賴性

8、(P＜0.05); PDK1 siRNA1下調(diào)細(xì)胞PDK1mRNA表達(dá)的能力強(qiáng)于濃度200nM的UCN-01(P＜0.05)。
　　 4．PDK1 siRNA、UCN-01對(duì)PDK1蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平的影響：PDK1siRNA1可下調(diào)PDK1、p-Akt蛋白表達(dá)，以轉(zhuǎn)染72h較顯著(P＜0.05); UCN-01也能夠下調(diào)細(xì)胞PDK1、p-Akt蛋白表達(dá)，且具有濃度依賴性和作用時(shí)間依賴性(P＜0.05); PDK1 si

9、RNA1下調(diào)細(xì)胞PDK1、p-Akt蛋白表達(dá)的能力比濃度200nM的UCN-01強(qiáng)(P＜0.05): PDK1 siRNA、UCN-01對(duì)于Akt蛋白表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。
　　 5．PDK1 siRNA、UCN-01對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響：與各對(duì)照組相比，PDK1 siRNA、UCN-01可提高細(xì)胞生長抑制率，且具有時(shí)間依賴性(P＜0.05)；UCN-01對(duì)生長抑制率的影響還具有濃度依賴性(P＜0.05

10、); PDK1 siRNA對(duì)細(xì)胞生長抑制率的影響強(qiáng)于濃度200nM的UCN-01(P＜0.05)。
　　 6．PDK1 siRNA、UCN-01對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響：PDK1 siRNA、UCN-01作用于EC9706細(xì)胞72h后早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞比例增加(P＜0.05）；UCN-01對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響具有濃度依賴性(P＜0.05); PDK1 siRNA1促進(jìn)EC9706細(xì)胞凋亡的能力比濃度200nM

11、的UCN-01更強(qiáng)（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1．PDK1 siRNA能有效沉默EC9706細(xì)胞PDK1基因的表達(dá)，下調(diào)其下游Akt蛋白磷酸化水平，從而阻斷PI3K/PDK1/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制EC9706細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明PDK1可能是食管癌分子治療的有效靶點(diǎn)
　　 2．PDK1化學(xué)抑制劑UCN-01能夠抑制EC9706細(xì)胞PDK1基因表達(dá)及Akt蛋白磷酸化，阻斷P13K/PDK1/