spink8基因?qū)κ彻馨〦C9706細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用.pdf

1、目的：食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，全世界每年約有20萬(wàn)人死于食管癌，對(duì)人類的生命和健康造成極大威脅。食管癌的病因尚未完全明了，通過(guò)多途徑探索，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與遺傳因素、亞硝胺慢性刺激、炎癥及創(chuàng)傷、糧食和蔬菜中的微量元素含量等相關(guān)，但其確切致病機(jī)制有待深入研究。EC9706細(xì)胞是來(lái)源于食管癌組織的細(xì)胞株，在體外以EC9706細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)于探討和認(rèn)識(shí)食管癌的生物學(xué)行為有重要的價(jià)值。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族（SPINK）

2、,成員包括SPINK1～12等多個(gè)亞族，該家族成員多與疾病和腫瘤相關(guān)，如spink1與胰腺癌相關(guān)，spink2與男性不育相關(guān)，spink7為食管癌相關(guān)基因等。spink7已被證實(shí)為腫瘤抑制基因，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制腫瘤遷移和侵襲等功能。以往的研究發(fā)現(xiàn),食管組織內(nèi)有SPINK8蛋白的內(nèi)源性表達(dá)，同時(shí)另一項(xiàng)全基因組比對(duì)結(jié)果顯示，spink8基因相對(duì)表達(dá)量在成人食管癌組織比正常食管及癌旁組織明顯減少。但有關(guān)SPINK8蛋白的功能研

3、究國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少。spink8與spink7具有同源性，且模擬三維結(jié)構(gòu)相似，但兩種蛋白的氨基酸序列有部分差異，推測(cè)這兩種蛋白特異性抑制的蛋白酶可能有所不同。本研究將根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)記錄的spink8 cDNA序列構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA的重組質(zhì)粒，并應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)，將干擾重組質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，觀察EC9706細(xì)胞中spink8基因的表達(dá)情況，并討論沉默spink8內(nèi)源性基因及過(guò)表達(dá)SPINK8蛋白對(duì)EC970

4、6細(xì)胞增殖、遷移和克隆形成能力的影響。實(shí)驗(yàn)將探索 spink8是否屬于抑癌基因，并初步闡述其作用方式，為食管癌的發(fā)生發(fā)展提供可能得新的理論機(jī)制，以求為治療提供新的作用靶點(diǎn)。
　　方法：⑴以spink8的mRNA已知序列為靶點(diǎn)，構(gòu)建pGenesil-SPINK8重組質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒。⑵重組干擾質(zhì)粒 pGenesil-SPINK8、陰性對(duì)照質(zhì)粒、重組過(guò)表達(dá)載體pEGFP-C1-SPINK8和空質(zhì)粒 pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染EC970

5、6細(xì)胞株，細(xì)胞分為5組，即未處理組、干擾組、陰性對(duì)照組、空載體組和過(guò)表達(dá)組，分別用半定量RT-PCR和Western Blotting檢測(cè)對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。⑶繪制MTT生長(zhǎng)曲線檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力。⑷克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成能力。⑸劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的體外遷移能力。⑹統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均由SPSS17.0軟件處理，定量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示；多組均數(shù)差異的比較采

6、用單因素方差分析（ANOVA），并用LSD-t法進(jìn)行組間比較；以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)建pGenesil-SPINK8重組質(zhì)粒，并且應(yīng)用限制性內(nèi)切酶SalⅠ進(jìn)行消化，證實(shí)重組質(zhì)粒能被切出長(zhǎng)約400 bp的小帶；測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的完全相符。②pGenesil-SPINK8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)和Western Blotting結(jié)果顯示，spink8在 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均受到

7、明顯抑制（P＜0.05）。③pEGFP-C1-SPINK8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)和Western Blotting結(jié)果顯示，spink8在mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯提高（P＜0.05）。⒁MTT生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SIPNK8蛋白能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖，而干擾其表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。⑤克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SPINK8蛋白的EC9706細(xì)胞體外克隆形成能力下降，而干擾其表達(dá)后克隆形成能力