Pim-3基因表達(dá)下調(diào)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響.pdf

1、背景和目的
　　 食管癌是一種較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，中國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū)，高發(fā)區(qū)遍及我國(guó)十余個(gè)省市，尤其在河南省林州市。食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段和多基因不斷演變的過(guò)程，但對(duì)其病因及發(fā)病機(jī)理仍不十分清楚。隨著醫(yī)療水平的提高，食管癌的治療現(xiàn)狀較過(guò)去已有明顯改善，但目前術(shù)后復(fù)發(fā)率仍很高，病人五年生存率仍然十分低下，難以滿足目前醫(yī)療發(fā)展的最終目標(biāo)。當(dāng)前興起的靶向基因治療已經(jīng)成為對(duì)放、化療效

2、果不滿意的腫瘤病人治療的一種新的替代手段。因而從分子水平上探討食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，找到針對(duì)抑制食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療、預(yù)防以及患者生存率和生存質(zhì)量的提高都具有極其重要的意義。
　　 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim是一種原癌基因，其蛋白激酶家族主要有三個(gè)成員，包括：Pim-1，Pim-2和Pim-3，其中Pim-3作為表達(dá)絲/蘇氨酸激酶活性的原癌基因pim家族中的一員，首次在

3、鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞中作為去極化誘導(dǎo)基因KID-1被證實(shí)的。KID-1基因與原癌基因Pim-1和Pim-2序列高度一致，于是命名為Pim-3。研究表明，Pim-3選擇性在內(nèi)皮起源的器官(包括肝臟、胰腺)的惡性病變，而不是正常的組織中表達(dá)。目前，國(guó)內(nèi)外研究者在肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌領(lǐng)域?qū)im-3基因的研究已有較大的進(jìn)展，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，迄今為止，在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)Pim-3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究報(bào)道，因此在本研究中

4、，作者利用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞中Pim-3的表達(dá)，通過(guò)RT-PCR和Western blotting技術(shù)研究Pim-3siRNA的轉(zhuǎn)入對(duì)EC9706細(xì)胞中Pim-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。利用CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒研究下調(diào)Pim-3的表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析下調(diào)Pim-3的表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，最后通過(guò)Real-time PCR和Western

5、blotting技術(shù)研究與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)的基因p21以及凋亡抑制因子bcl-2和凋亡促進(jìn)因子bax mRNAs和蛋白表達(dá)的變化，該研究旨在初步探討Pim-3基因在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的可能作用，進(jìn)一步為尋找靶向治療食管鱗狀細(xì)胞癌的新的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1將Pim-3 siRNA和對(duì)照siRNA分別利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞，細(xì)胞分為三組，即未處理組、對(duì)照siRN

6、A組和Pim-3 siRNA組，分別用于下面的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、半定量RT-PCR及Westernblotting分析。
　　 2采用新型的CCK-8試劑盒分析轉(zhuǎn)染Pim-3和對(duì)照siRNAs后對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 3運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)Pim-3表達(dá)后，食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化。
　　 4采用半定量RT-PCR和Western blott

7、ing方法檢測(cè)三組細(xì)胞中細(xì)胞增殖和周期相關(guān)因子p21以及凋亡相關(guān)因子bcl-2和bax mRNA和蛋白的表達(dá)水平的變
　　 5 RT-PCR和Western blotting結(jié)果應(yīng)用Image Pro Plus5.0軟件進(jìn)行灰度值分析，上述所有的實(shí)驗(yàn)均分別重復(fù)至少三次。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05

8、具有顯著性。
　　 結(jié)果
　　 1 Pim-3 siRNA轉(zhuǎn)染后，Pim-3基因的mRNA和蛋白表達(dá)均下降為未處理組和對(duì)照siRNA組的約1/5。未處理組和對(duì)照siRNA組之間Pim-3的表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。
　　 2在未處理組和對(duì)照siRNA組的EC9706細(xì)胞中，EC9706細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。然而，與未處理組和對(duì)照siRNA組相比，Pim-3 siRNA組在轉(zhuǎn)染24h以后EC97

9、06細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(P<0.05)。
　　 3細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，未處理組和對(duì)照siRNA組中EC9706細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)比率分別為39.38％和40.25％，顯著低于Pim siRNA組中G0/G1期的細(xì)胞數(shù)(60.93％)(P<0.01)，而G2/M期細(xì)胞數(shù)表現(xiàn)出相反的結(jié)果，即G2/M期受阻。
　　 4細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48h后，AnnexinⅤ檢測(cè)的Pim-3 siRNA組細(xì)胞早期凋亡率為1

10、9.26％，顯著高于未處理組和對(duì)照siRNA組的早期凋亡率(凋亡率分別為：5.15％和6.05％)(P<0.05)，而未處理組和對(duì)照siRNA組的EC9706的活細(xì)胞數(shù)分別為93.01％和91.96％，顯著高于Pim-3 siRNA組的活細(xì)胞數(shù)(78.73％)(P<0.05)。
　　 5 RT-PCR和Western blotting結(jié)果表明，與未處理組和對(duì)照siRNA組相比，Pim-3 siRNA組中bcl-2 mRNA和蛋白

11、的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)，但p21和bax mRNA和蛋白的表達(dá)水平反而明顯上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)此外，未處理組和對(duì)照siRNA組之間上述基因的表達(dá)水平均沒(méi)有差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1利用RNA干擾技術(shù)能有效下調(diào)食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞中Pim-3mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 2 Pim-3基因表達(dá)下調(diào)能明顯抑制食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期