Cdc25A反義寡核苷酸對人食管鱗癌EC9706細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景與目的:
　　我國是食管癌的高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率位于世界首位，河南省是食管癌的高發(fā)省份，同時也是造成當(dāng)?shù)匕┌Y死亡的主要原因。目前的治療方法效果均不甚滿意，并且存在一定的局限性。尋找導(dǎo)致食管癌惡性增殖的分子靶點(diǎn)并對其靶向治療成為近年來食管癌治療研究的熱點(diǎn)之一。
　　在哺乳動物細(xì)胞中存在3種Cdc25同源基因，其中Cdc25A是一個促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入到S期必須的細(xì)胞周期調(diào)控磷酸酶，能夠?qū)⒓?xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cycl

2、in-dependentkinase，CDK）蘇氨酸、酪氨酸殘基抑制性磷酸化，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。已有報道表明在肝癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌等一些常見腫瘤中Cdc25A表達(dá)水平顯著增高，但有關(guān)Cdc25A表達(dá)在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未見文獻(xiàn)報道。
　　為探討Cdc25A基因的異常表達(dá)在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，本研究采用Cdc25A反義寡聚核苷酸(antisenseoligonucleotide，ASODN)處理食管癌

3、EC9706細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞中Cdc25A、CDK2、cyclinE蛋白的表達(dá)，采用原位雜交技術(shù)檢測細(xì)胞中Cdc25A、CDK2、cyclinE的mRNA的表達(dá)。運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖情況。
　　方法:
　　1.設(shè)計合成Cdc25A反義寡核苷酸(Cdc25AASODN)、無關(guān)寡核苷酸序列(Cdc25AN-ODN)，分別用不同濃度(5μmol/ml、10μmol/ml、15μmol/ml)的Cdc

4、25AASODN和Cdc25AN-ODN轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞24h、48h、72h。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照組。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同濃度各組細(xì)胞中Cdc25A、cyclinE、CDK2的蛋白表達(dá)情況。
　　3.原位雜交檢測各組細(xì)胞中Cdc25A、cyclinE、CDK2的mRNA表達(dá)情況。
　　4.采用CCK-8試劑盒檢測轉(zhuǎn)染Cdc25AASODN和Cdc25AN-ODN后對食管癌EC9706細(xì)胞增殖能

5、力的影響。
　　5.使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.與對照組比較ASODN組中Cdc25A蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，且有濃度依賴性和時間依賴性，Cdc25A的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染濃度的增加以及時間的延長而減少。濃度為15μmol/mlCdc25AASODN作用72h效應(yīng)最好。
　　2.ASODN組中cyclinE蛋白和mRNA表達(dá)較空白對照和N-ODN

6、組顯著降低(P＜0.05)，且隨著濃度或時間的增加而其表達(dá)隨之降低，在同一時間的不同濃度和同一濃度的不同時間均有顯著性差異(P＜0.05)。濃度為15μmol/mlCdc25AASODN作用72h時效應(yīng)最好。
　　3.ASODN組中CDK2蛋白和mRNA表達(dá)較空白對照和N-ODN組顯著降低(P＜0.05)，且隨著濃度或時間的增加而其表達(dá)隨之降低，在同一時間的不同濃度和同一濃度的不同時間均有顯著性差異（P＜0.05）。濃度為15μm

7、ol/mlCdc25AASODN作用72h時效應(yīng)最好。
　　4.N-ODN組和空白對照組EC9706細(xì)胞的增殖無明顯差異(P＞0.05)。ASODN組與N-ODN組和空白對照組相比存轉(zhuǎn)染2d細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Cdc25AASODN能特異性的抑制食管鱗癌EC9706細(xì)胞中Cdc25A蛋白和mRNA表達(dá)，同時下調(diào)cyclinE、CDK2蛋白和mRNA表達(dá)。
　　2.Cdc2