小白菊內(nèi)酯對人食管癌細胞EC9706的增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景和目的
　　 食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。由于食管癌進展快,易發(fā)生浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,加上術(shù)后化療藥物副作用大,腫瘤對化療藥物易產(chǎn)生抵抗性,因此,多數(shù)食管癌患者預(yù)后不佳。尋找安全、副作用小、對腫瘤特異的有效抗腫瘤藥物是醫(yī)學(xué)界的重大課題。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor kappaB,NF-κB)是由Sen和Baltimore在二十多年前發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)。它可以激活與腫

2、瘤增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和凋亡有關(guān)的重要基因的表達,大量的研究表明,食管癌中有NF-κB的持續(xù)性表達,它與食管癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和抗凋亡密切相關(guān)。
　　 小白菊內(nèi)酯(parthenolide,PN)是墨西哥印第安藥用植物小白菊的化學(xué)成分,具有抗炎作用。最近發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤都有抑制作用；與化療藥物聯(lián)合使用可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,而對正常細胞無殺傷作用。據(jù)報道,PN是NF-κB的有效抑制劑,通過抑制NF-κB的活化,抑制腫瘤

3、細胞的增殖,促進腫瘤細胞凋亡。
　　 目前,小白菊內(nèi)酯對食管癌的研究報道極少,本實驗以人食管癌細胞株EC9706為研究對象,研究PN對食管癌細胞的增殖和凋亡的影響,探討PN抗腫瘤的機制。
　　 材料與方法
　　 1.標本:人食管癌細胞EC9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所王明榮教授惠贈,河南省腫瘤病理重點實驗室凍存。經(jīng)復(fù)蘇孵育,傳代培養(yǎng),分為不同的實驗組。
　　 2.倒置顯微鏡觀察不同濃度PN作用EC97

4、06細胞24h、48h、72h后形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.采用MTT法檢測不同濃度PN及PN與5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)聯(lián)合作用EC9706細胞24h、48h、72h后,細胞增殖活性的變化。
　　 4.采用免疫細胞化學(xué)SP法檢測各組EC9706細胞中血管內(nèi)皮生長因子(vescular endothelium growth factor,VEGF)、NF-κBp65蛋白和Ki-67抗原表達。

5、>　　 5.采用原位雜交技術(shù)檢測各組EC9706細胞中NF-κBp65mRNA表達。
　　 6.采用流式細胞技術(shù)檢測各組EC9706細胞的凋亡變化情況。
　　 7.采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(X±S)表示,MTT實驗結(jié)果采用重復(fù)測量資料的方差分析；兩組以上均數(shù)的比較用單因素方差分析；以α=0.05為顯著性檢驗水準。
　　 結(jié)果：
　　 1.在倒置顯微鏡下,食管

6、癌細胞EC9706呈多邊形,對數(shù)生長期的EC9706常融合成片,細胞連接緊密。實驗組EC9706細胞與對照組相比,細胞數(shù)量減少,細胞連接消失,高濃度PN作用后所有細胞固縮變圓,核濃縮、核漿分布不清,細胞溶解碎裂。溶劑對照組未出現(xiàn)上述變化。
　　 2.MTT實驗結(jié)果:20μmol/L的PN對EC9706細胞的增殖有抑制作用,抑制率為8.64％。不同濃度的PN(20-100μmol/L)、5-FU(25μg/mL和50μg/mL)及

7、PN(20μmol/L)與5-FU(25μg/mL)聯(lián)合作用于EC9706細胞24h、48h和72h后均不同程度的抑制細胞增殖。同一時間段內(nèi)不同濃度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=203.392,P<0.05),相同的濃度不同作用時間組的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=401.093,P<0.05),時間組和濃度組間有交互作用(F=15.604,P<0.05)。PN100μmol/L24h的抑制率為39.39％,48h為48.03％,72h時間

8、段PN40μmol/L和50μmol/L組的抑制率達45.56％和50.05％。溶劑對照組的抑制率在2.67％-5.59％之間,與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合組24h的抑制率(66.53％)與5-FU50μg/mL作用48h的抑制率(64.07％)相當；聯(lián)合組48h的抑制率(92.37％)與5-FU50μg/mL作用72h的抑制率(93.16％)相當。
　　 3.細胞免疫化學(xué)結(jié)果:食管癌EC9706細胞高

9、表達VEGF、NF-κBp65蛋白和Ki-67抗原。不同濃度的PN(20-50μmol/L)、5-FU(25μg/mL)及PN(20μmol/L)與5-FU(25μg/mL)聯(lián)合作用EC9706細胞24h、48h和72h后VEGF、NF-κBp65蛋白和Ki-67抗原表達逐漸降低,三個時間段不同濃度組間的比較及相同濃度不同作用時間的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PN抑制EC9706細胞中VEGF、NF-κBp65蛋白和Ki-67

10、抗原表達具有時間和劑量依賴性。5-FU(25μg/mL)組中NF-κBp65蛋白的表達與對照組比較略有升高。與5-FU(25μg/mL)組相比,聯(lián)合組中EC9706細胞中NF-κBp65蛋白的表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.原位雜交結(jié)果:食管癌EC9706細胞中NF-κBp65mRNA活性高,不同濃度的PN(20-50μmol/L)作用EC9706細胞24h、48h和72h后NF-κBp65mRNA活性逐

11、漸降低,三個時間段內(nèi)不同濃度組間的比較及相同濃度不同時間段的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PN抑制EC9706細胞中NF-κBp65mRNA的活性具有時間和劑量依賴性；5-FU(25μg/mL)組EC9706細胞中NF-κBp65mRNA活性略有增強；聯(lián)合組NF-κBp65mRNA的活性明顯降低,與單一5-FU組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.流式細胞術(shù)結(jié)果:三個時間段不同濃度PN組、單一5-FU組

12、和聯(lián)合組與對照組比較,細胞早期凋亡率和晚期凋亡率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；相同濃度不同作用時間組的早期凋亡率和晚期調(diào)亡率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.小白菊內(nèi)酯可以抑制食管癌EC9706細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　 2小白菊內(nèi)酯可以增加EC9706對化療藥5-FU的敏感性。
　　 3.小白菊內(nèi)酯抗腫瘤機制可能與抑