姜黃素誘導人食管癌Ec-9706細胞凋亡及其機制的研究.pdf

1、目的：食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，我國是食管癌的高發(fā)國家，每年因食管癌死亡的人數(shù)占全部惡性腫瘤死亡的近四分之一。目前治療食管癌除早期手術(shù)，化學藥物已成為治療惡性腫瘤的重要方法，但是絕大多數(shù)化學藥物的細胞毒作用缺乏特異性，在殺死腫瘤細胞的同時，無選擇的殺傷正常細胞。因此，尋找毒副作用小，抗瘤活性強的化療藥物已成為國內(nèi)外研究的熱點。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種植物多酚，可用于食品上色及佐味。近年研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用廣泛，如

2、抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗動脈硬化及抗腫瘤等作用。尤其姜黃素可誘導多種腫瘤細胞凋亡，作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌藥物，日益引起人們的關(guān)注，但對人食管癌的作用及分子機制研究較少，本研究通過體外培養(yǎng)人食管癌Ec-9706細胞，研究姜黃素作用后細胞形態(tài)、細胞凋亡及其調(diào)控基因表達的影響，探討姜黃素在食管癌細胞中的作用機制，為食管癌的化學防治提供實驗依據(jù)。 腫瘤發(fā)生不僅是瘤細胞的過度增生，還存在死亡過少，凋亡機制障礙，細胞凋亡參與腫

3、瘤起始過程，并對腫瘤發(fā)生發(fā)展起負調(diào)控作用。本研究運用多種實驗技術(shù)，對細胞凋亡中凋亡抑制蛋白因子(Livin)，促凋亡因子(Smac)和Caspase-3進行檢測和分析，以期進一步闡明細胞凋亡調(diào)控基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：將Ec-9706細胞于37℃，飽和濕度5％CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。 1.應(yīng)用光鏡觀察細胞形態(tài)學變化：將不同濃度的姜黃素作用于Ec-9706細胞，在倒置相差顯微鏡下

4、定時觀察細胞的生長情況并照相。 2.采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測藥物對細胞的生長抑制作用。 3.流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞凋亡、細胞周期分布：收集經(jīng)不同濃度姜黃素作用12h、24h、48h的Ec-9706細胞及對照組細胞，冷PBS漂洗。預冷70％乙醇4℃，固定，上機檢測前離心去固定液，0.5％胃蛋白酶消化，碘化丙錠(PropidiumIodide，PI：50mg/L Trinton X-100 1.0％)室溫避光

5、染色。流式細胞儀上機檢測，應(yīng)用軟件進行分析。 4 FCM檢測caspase-3蛋白的表達：收集經(jīng)不同濃度姜黃素作用12h、24h、48h的Ec-9706細胞及對照組細胞，按常規(guī)方法進行熒光標記，流式細胞儀檢測熒光強度，以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的表達情況。 5 應(yīng)用免疫細胞化學方法觀察細胞凋亡調(diào)控因子Smac、Caspase3蛋白表達的變化。 6 western blot半定量檢測基因蛋白Livin、Smac、C

6、aspase3表達，并分析各蛋白表達之間的相關(guān)性及其在姜黃素抗食管癌中的作用機制。 結(jié)果： 姜黃素對Ec-9706細胞凋亡及其調(diào)控基因的影響 1.經(jīng)40、80、120、160μmol/ml姜黃素處理Ec-9706細胞12h、24h和48h后，倒置相差顯微鏡下觀察，與對照組相比，用藥組的細胞生長明顯被抑制，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，核漿比例降低，部分細胞變圓而懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。提示Ec-9706細胞趨于凋亡。 2.

7、分別用姜黃素(0、40、80、120、160μmol/ml)作用于Ec-9706細胞12、24、48h，MTT結(jié)果顯示姜黃素能明顯抑制Ec-9706細胞的增殖，并呈劑量和時間依賴性。作用12h、24h和48h后，Ec-9706細胞半數(shù)抑制率(inhibitory concentration giving 50％inhibition，IC50)分別為216.1447μmol/ml ，148.0635μmol/ml和113.8045μmol

8、/ml(p＜0.01)。最高增殖抑制率為：應(yīng)用160μmol/ml姜黃素處理Ec-9706細胞48小時后，其增殖抑制率達到73.19％。溶劑對細胞生長未見明顯影響(P＞0.05)。 3.流式細胞儀分析細胞凋亡，在DNA組方圖上出現(xiàn)典型的亞二倍體峰即“凋亡峰”。40、80、120和160μmol/ml姜黃素作用12h后的凋亡率分別為6.01±1.04％、9.26±2.11％、13.31±1.54％和20.16±2.85％，與對照組

9、的1.70±0.32％相比，差異有顯著性(P＜0.05)。藥物作用24h后的凋亡率分別為8.74±0.98％、11.63±1.74％、21.67±2.34％、36.17±2.78％，與對照組的2.12±0.48％相比，差異有顯著性(P＜0.01)。藥物作用48h后凋亡率分別為9.14±1.62％、17.74±1.87％、30.82±2.48％和44.35±3.42％，與對照組的2.87±0.54％相比，差異有顯著性(P＜0.01)。并做

10、各用藥濃度組作用不同時間細胞凋亡率的方差分析，表明差異有顯著性(P＜0.05)。pearson關(guān)聯(lián)性分析，劑量依賴(r=0.8371，P＜0.01)與時間依賴(r=0.6912，P＜0.01)。說明Ec-9706細胞凋亡率與姜黃素作用呈劑量和時間依賴關(guān)系。姜黃素作用后，Ec-9706細胞在細胞周期中的分布發(fā)生了明顯的變化，隨著作用時間延長和藥物濃度的增加，G0/G1期細胞數(shù)逐漸增加，S和G2/M期細胞數(shù)逐漸減少。經(jīng)藥物濃度和作用時間方差

11、分析，差異有顯著性(P＜0.05)。pearson關(guān)聯(lián)性分析，劑量依賴(r=0.7147，P＜0.01)與時間依賴(r=0.6912，P＜0.05)。 4 FCM檢測姜黃素作用后Caspase-3蛋白表達用0、40、80、120和160gmol/ml姜黃素處理細胞，于12、24h和48h收集細胞，用流式細胞儀檢測Caspase-3蛋白表達。Caspase-3蛋白平均熒光指數(shù)(FI)：12h組蛋白表達分別為(1.00±0.00)(

12、1.05±0.07)(1.18±0.04)(1.23±0.09)(1.72±0.11)；24h組分別為(1.00±0.03)(1.27±0.04)(1.43±0.04)(1.89±0.07)(2.11±0.13)；48h組分別為(1.00±0.02)(1.31±0.05)(1.81±0.03)(2.09±0.08)(2.35±0.07)，與對照組比較，均有顯著性差異(P＜0.01)。隨著藥物濃度、作用時間的增加，Caspase-3表達逐

13、漸增高，呈正相關(guān)關(guān)系，劑量依賴(r=0.8722，P＜0.01)，時間依賴(r=0.7261，P＜0.05)。 5 0、40、80、120、160μmol/ml姜黃素對Ec-9706細胞分別作用12、24、48h小時后進行免疫細胞化學檢測，對照組中，Smac和Caspase3蛋白在細胞中呈弱陽性表達，姜黃素作用后，細胞中的蛋白表達水平明顯升高。 6 western blot半定量檢測基因蛋白表達，隨著姜黃素藥物濃度的增高

14、，Smac、Caspase3表達水平逐漸升高，Livin表達水平逐漸降低，而且有明顯的量效依賴關(guān)系。 結(jié)論： 1.姜黃素可明顯抑制人食管癌Ec-9706細胞的增殖，并使細胞周期受到阻滯，進一步誘導腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。抑制細胞增殖與誘導凋亡呈時間和劑量依賴關(guān)系。 2.人食管癌Ec-9706細胞中存在Livin蛋白的高表達，姜黃素作用后Livin蛋白表達顯著下調(diào)，減弱了其對細胞凋亡的負性調(diào)控，從而誘導腫

15、瘤細胞凋亡。 3.姜黃素作用后Smac蛋白表達上調(diào)，Smac蛋白表達水平增高，促進了解除livin對Caspase的抑制效應(yīng)而激活procaspase-3，成為有活性的Caspase-3，發(fā)揮其誘導腫瘤細胞凋亡的作用。 4 Caspase-3蛋白隨藥物濃度的增高及作用時間的延長而表達量明顯升高。Caspase-3經(jīng)蛋白水解作用而被激活，從而產(chǎn)生了Caspase自我放大級聯(lián)反應(yīng)，進而裂解DNA損傷細胞，發(fā)生腫瘤細胞的凋亡。