shRNA沉默livin基因?qū)θ藧盒院谒亓鯝375細(xì)胞周期和凋亡的影響.pdf

1、目的：腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是一類(lèi)內(nèi)源性細(xì)胞抑制因子，其過(guò)度表達(dá)引起凋亡不足與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。因此以IAP為靶點(diǎn)，尋找治療惡性腫瘤的新途徑，成為當(dāng)今腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。Livin是IAP家族成員之一，Vucic等因該基因在人黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)，又稱(chēng)之為ML—IAP（melanoma IAP），特異的分布

2、于多種腫瘤組織，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥相關(guān)，將可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建針對(duì)人livin基因的小干擾RNA表達(dá)載體，觀察對(duì)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞凋亡和周期的影響，為探索惡性黑素瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：研究對(duì)象為人惡性黑素瘤A375細(xì)胞株。采用：（1）基因克隆技術(shù)構(gòu)建pGPU6—GFP—livin—shRNA表達(dá)載體。（2）通過(guò)培養(yǎng)A375細(xì)胞、細(xì)胞轉(zhuǎn)染，利用熒光顯微鏡觀察pGPU6—GFP—li

3、vin—shRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。（3）分別獲取各組（空白組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2）總RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后livin mRNA的表達(dá)變化情況。（4）通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)A375細(xì)胞的凋亡情況。（5）PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況。 結(jié)果：（1）采用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建pGPU6—GFP—livin—shRNA表達(dá)載體，并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人惡性黑素瘤A375細(xì)胞株

4、，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。（2）熒光定量PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的A375細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48h livin mRNA表達(dá)量分別下降了17%和42%，轉(zhuǎn)染后72h livin mRNA表達(dá)量分別下降了71%和61%，48h到72h干擾片段的沉默效應(yīng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)。（3）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后48h A375細(xì)胞凋亡率：實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2（31.00±2.25%和34.72±1.29%）高于空白組（3.21±2.10%）（P<

5、0.05），脂質(zhì)體組和陰性對(duì)照組（7.67±1.34%和6.84±1.34%）與空白組相比無(wú)差異（P>O.05>；轉(zhuǎn)染后72h A375細(xì)胞凋亡率：實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2（34.90±1.71%和38.59±1.31%）高于空白組（3.87±3.04%）（P<0.05），陰性對(duì)照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（7.44±1.69%和7.89±1.44）與空白組相比無(wú)差異（P>0.05）。（4）PI單染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后48h，shRNA—2可引起

6、G0/G1期細(xì)胞數(shù)升高，S期細(xì)胞數(shù)下降，siRNA—1作用不明顯，轉(zhuǎn)然后72h shRNA—1、2均能引起引起G0/G1期細(xì)胞數(shù)升高，S期細(xì)胞數(shù)下降。 結(jié)論：（1）設(shè)計(jì)出針對(duì)livin共有序列的發(fā)卡樣shRNA寡核苷酸片段。（2）成功構(gòu)建出針對(duì)livin的shRNA表達(dá)載體pGPU6—GFP—livin—shRNA—1、pGPU6—GFP—livin—shRNA—2。（3）shRNA—1和2均能減少A375細(xì)胞中l(wèi)ivin mR