HINT1基因?qū)θ撕谒亓黾毎鸄375生物學行為影響的實驗研究.pdf

1、黑素瘤是惡性程度很高的皮膚腫瘤，其發(fā)生機制目前仍不十分清楚。腫瘤抑制基因在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1(histidine triad nucleotide-binding protein 1，HINTl)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中表達下降，但其功能尚不完全清除。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，HINT1基因在人黑素瘤中表達下降。本試驗旨在研究HINT1基因?qū)θ撕谒亓黾毎鸄375生物學行為的影響，以探討

2、其在人黑素瘤發(fā)生中的作用及機理。
　　 1、低表達HINT1的黑素瘤細胞株的篩選
　　 應(yīng)用半定量RT-PCR及蛋白印跡法檢測了人黑素瘤細胞A375及M14中HINT1的表達情況，選取低表達HINT1的A375細胞用于后續(xù)的試驗。
　　 2、HINT1重組真核表達載體的構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定
　　 應(yīng)用RT-PCR法從人結(jié)腸癌細胞SW480中獲得HINT1編碼區(qū)基因片段，體外構(gòu)建重組真核表達載體pcD

3、NA.3.1/myc-His(-)A-HINT1，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及基因測序檢測證實此重組真核表達載體構(gòu)建正確。將其脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人黑素瘤細胞A375，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細胞。免疫細胞化學法及蛋白印跡法均證實，該細胞可高表達HINT1蛋白。
　　 3、HINT1對A375細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制的探討
　　 經(jīng)MTT、流式細胞術(shù)及TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，高表達HINT1在體外可顯著抑制A375細胞

4、增殖，促進其凋亡，并導致細胞周期出現(xiàn)G1期阻滯。分光光度法及蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，高表達HINT1可導致bax、CytochromeC及p53表達增加，bcl-2表達降低，激活Caspase9及Caspase3，從而通過線粒體依賴凋亡途徑誘導A375細胞凋亡。
　　 4、HINT1對A375細胞裸鼠皮下異種移植瘤生長的影響
　　 高表達HINT1在裸鼠體內(nèi)可顯著抑制A375細胞裸鼠皮下異種移植瘤的生長，腫瘤體積及重量均顯著

5、降低。組織病理結(jié)果顯示，HINT1高表達組腫瘤團塊體積較小，細胞異型性低，腫瘤團塊內(nèi)僅見少數(shù)局灶性壞死。
　　 5、結(jié)論：
　　 HINT1在體內(nèi)、外均能有效地抑制人黑素瘤細胞A375的生長，在體外還能引起A375細胞細胞周期G1期阻滯，并通過線粒體依賴凋亡途徑誘導細胞凋亡。提示HINT1是一個腫瘤抑制基因，具有抑制人黑素瘤細胞增殖、促進其凋亡的功能，在黑素瘤的發(fā)生及發(fā)展中具有重要的作用，可作為黑素瘤基因治療潛在的候選基