GKLF基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞株SGC-7901生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分GKLF、IKLF在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義
　　 目的：研究胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中GKLF、IKLF的表達(dá)及臨床意義。方法：采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中GKLFmRNA、IKLFmRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測胃癌組織及其遠(yuǎn)端正常胃組織中GKLF、IKLF蛋白的表達(dá)，Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)檢測人正常胃上皮細(xì)胞株GES-1及胃癌細(xì)胞株MKN-28、SG

2、C-7901、BGC-823、HGC-27中GKLF、IKLF蛋白的表達(dá)。結(jié)果：胃癌組織中GKLFmRNA的相對表達(dá)量明顯低于遠(yuǎn)端正常胃組織、IKLFmRNA的相對表達(dá)量明顯高于遠(yuǎn)端正常胃組織(P<0.05）、胃癌組織中GKLFmRNA、IKLFmRNA的表達(dá)水平與組織分化程度無關(guān)，GKLF蛋白總陽性率顯著低于遠(yuǎn)端正常胃組織、IKLF蛋白總陽性率顯著高于遠(yuǎn)端正常胃組織(P<0.05），GKLF、IKLF蛋白表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、分

3、化程度、Lauren分型無關(guān)，與淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān)(P<0.05)；胃癌細(xì)胞株中GKLFmRNA和蛋白的相對表達(dá)量低于人正常胃上皮細(xì)胞株GES-1、IKLFmRNA和蛋白的相對表達(dá)量則高于細(xì)胞株GES-1(P<0.05)。結(jié)論：胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中存在GKLF低表達(dá)、IKLF高表達(dá)，GKLF、IKLF在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用，檢測GKLF、IKLF的表達(dá)有助于判斷胃癌患者病情程度和預(yù)后。
　　 第二部分重

4、組質(zhì)粒pcDNA3.1-GKLF的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立
　　 目的：建立高表達(dá)GKLF的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，以進(jìn)一步觀察其對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生物學(xué)行為的影響。方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GKLF轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，通過G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF細(xì)胞株，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法、Westernblot和ICC法檢測GKLFmRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)

5、果：建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF細(xì)胞株，成功地表達(dá)目的基因。結(jié)論：成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF細(xì)胞株，為下一步探討GKLF基因?qū)ξ赴┥飳W(xué)行為影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分GKLF基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生物學(xué)行為影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：體外觀察外源性GKLF基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖活性和侵襲力的影響，探

6、討GKLF在胃癌中的作用機(jī)制。方法：應(yīng)用MTT法（四甲基偶氮唑藍(lán)比色法）、流式細(xì)胞儀、克隆形成實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別研究GKLF基因轉(zhuǎn)染前、后人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖和侵襲活性的變化。RT-PCR法、Westernblot法分別檢測GKLF基因轉(zhuǎn)染前、后人胃癌細(xì)胞株SGC-7901中細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Ki-67、E-鈣粘附分子(E-cadherin)mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與SGC-7901組和SGC

7、7901-pcDNA3.1組相比，SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組細(xì)胞生長速度減慢、細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期部分阻滯、克隆形成率低、細(xì)胞侵襲力明顯減弱(P<0.05）。SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組細(xì)胞CyclinD1、Ki-67、E-cadherinmRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于SGC-7901組和SGC7901-pcDNA3.1組（P<0.05）。結(jié)論：GKLF基因可能通過下調(diào)CyclinD1、Ki-67、E-

8、cadherin的表達(dá)，而使人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖活性和侵襲力降低。
　　 第四部分GKLF基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生物學(xué)行為影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：體內(nèi)觀察外源性GKLF基因轉(zhuǎn)染對人胃癌裸鼠皮下移植瘤生長、轉(zhuǎn)移的影響，并探討GKLF在胃癌中的作用機(jī)制，從而為胃癌的基因治療提供新的思路。方法：選用36只BALB/C-nu/nu裸鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分兩批進(jìn)行。每批裸鼠18只，各隨機(jī)分為三組，

9、每組分別注射等量的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF、SGC7901-pcDNA3.1和SGC-7901細(xì)胞(2×107個(gè)/200μl/只)。第一批，將細(xì)胞注射于每只裸鼠右脅腹前肢皮下，接種6周后處死裸鼠，觀察腫瘤生長狀況、成瘤潛伏期，IHC法檢測裸鼠皮下移植瘤組織內(nèi)GKLF、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表達(dá)情況，測定皮下移植瘤組織中MVD值；同時(shí)用B超觀察皮下移植瘤大小、血流信號及腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。第二批，將細(xì)

10、胞經(jīng)尾靜脈接種于裸鼠，接種6周后處死裸鼠，顯微鏡下觀察有無肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果：與SGC-7901組和SGC7901-pcDNA3.1組相比，SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組成瘤潛伏期延長、皮下移植瘤體積和瘤重較小(P<0.05)，皮下移植瘤組織內(nèi)GKLF蛋白表達(dá)升高、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表達(dá)均降低，微血管密度(MVD)值降低。B超顯示：SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組皮下移植瘤較小，血流信號I