PTEN過表達(dá)及突變對肝星狀細(xì)胞黏附與遷移的影響.pdf

1、目的:探討過表達(dá)的野生型第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten，PTEN）及其突變體G129E基因（僅保留蛋白磷酸酶活性而喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性）對體外培養(yǎng)的活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）黏附與遷移的影響。
　　方法:利用293A細(xì)胞擴(kuò)增實驗所需的腺病毒（Ad-PTEN、A

2、d-G129E、Ad-GFP），并測定滴度；以腺病毒為載體將具有雙重特異性磷酸酶活性的野生型PTEN基因及僅保留了蛋白磷酸酶活性的PTEN突變體G129E基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化大鼠HSC（HSC-T6株）；采用Western blot檢測HSC的PTEN蛋白表達(dá)；應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色法及MTT比色法測定HSC黏附能力；采用細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗測定HSC的平面遷移能力；應(yīng)用Transwell小室測定HSC的跨膜遷移能力。所有資料均應(yīng)用Excel2

3、003建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗分組如下：①對照組（Control組）：病毒轉(zhuǎn)染時以DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替腺病毒；②空病毒組（Ad-GFP組）：轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的載體空病毒；③PTEN重

4、組腺病毒組（Ad-PTEN）：轉(zhuǎn)染攜帶野生型PTEN基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒；④G129E重組腺病毒組（Ad-G129E組）：轉(zhuǎn)染攜帶G129E基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒。
　　結(jié)果:
　　1.通過反復(fù)感染293A細(xì)胞的方法，獲得實驗所需腺病毒液Ad-GFP、Ad-PTEN及Ad-G129E，其滴度分別為：1.6×109pfu/mL、1.3×109pfu/mL、1.4×109pfu/mL。
　　2.M.O.I.值

5、100時，腺病毒感染HSC后48h，計數(shù)GFP熒光陽性表達(dá)細(xì)胞，測的Ad-GFP、Ad-PTEN及Ad-G129E各組腺病毒感染率均＞80％。
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染后48h，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測各組HSC的PTEN蛋白表達(dá)顯示：Ad-PTEN組（1.08±0.07）、Ad-G129E組（0.97±0.04）明顯高于Control組（0.56±0.05）及Ad-GFP（0.69±0.07），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0

6、5）；而Control組與Ad-GFP組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間均無顯著差異（P＞0.05）。
　　4.甲苯胺藍(lán)染色法測定HSC黏附力顯示：在腺病毒感染HSC48h，與Control組相比，Ad-GFP組細(xì)胞黏附抑制率（1.89±0.88）%，無顯著差異（P＞0.05）；Ad-PTEN組細(xì)胞黏附抑制率（20.38±4.37）%及Ad-G129E組細(xì)胞黏附率（19.57±3.78）%顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜

7、0.05）；但Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間細(xì)胞黏附率無顯著差異（P＞0.05）。
　　5.MTT比色法檢測HSC黏附力顯示：與Control組相比，Ad-GFP組細(xì)胞黏附抑制率（6.17±4.98）%，無顯著差異（P＞0.05）；Ad-PTEN組細(xì)胞黏附抑制率（38.13±6.93）%及Ad-G129E組細(xì)胞黏附率（35.83±4.24）%顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但Ad-PTEN組與Ad-G129E

8、組之間細(xì)胞黏附率無顯著差異（P＞0.05）。
　　6.細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗結(jié)果顯示：劃痕后12h各組HSC均有遷移，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；劃痕后24h HSC由兩側(cè)向中間遷移距離，Ad-PTEN組（332.35±6.23μm）、Ad-G129E組（336.77±5.25μm）明顯低于Control組（391.34±10.41μm）及Ad-GFP組（392.66±10.41μm）（P＜0.05），而Control組與Ad-

9、GFP組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間均無顯著差異（P＞0.05）；劃痕后48h HSC由兩側(cè)向中間遷移距離，與Control組（551.68±8.91μm）相比，Ad-PTEN組（468.74±19.29μm）及Ad-G129E組（462.48±13.47μm）明顯減低（P＜0.05），且較24小時降低更加明顯，而Ad-GFP組（550.81±11.55μm）與Control組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間差異

10、均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　7.Transwell小室細(xì)胞跨膜遷移實驗結(jié)果顯示：Ad-PTEN組跨膜細(xì)胞數(shù)（38.67±4.50）、Ad-G129E組跨膜細(xì)胞數(shù)（33.33±3.83）較Control組（67.67±6.28）及Ad-GFP組（64.67±5.53）顯著減少（P＜0.05），而Ad-PTEN組與Ad-G129E組及Control組與Ad-GFP組之間跨膜細(xì)胞數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論