內源性TGFβ1對肝星狀細胞IGFBPrPl表達的影響及意義.pdf

1、正常肝臟在各種慢性肝病損傷下,引起持續(xù)或反復的肝實質炎癥壞死,使得纖維結締組織大量增生,而其降解相對不足,大量細胞外基質(extracellular matrix,ECM)沉積形成肝纖維化,進一步進展則導致肝硬化的發(fā)生。如果能給予有效的治療,則已經形成的肝纖維化可以逆轉。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)由靜息態(tài)被激活是肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié)和細胞學基礎,活化的HSC能合成和分泌ECM,導致ECM在肝內過量沉

2、積。
　　 轉化生長因子pi(transforming growth factor beta l,TGFpi)能夠促進HSC轉變?yōu)榧〕衫w維樣細胞,增加細胞外基質的產生,減少基質的降減,并抑制肝細胞再生及誘導凋亡,在肝纖維化的發(fā)生中起到重要作用,被認為是目前最強的致纖維化因子。
　　 胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白l(insulin-like growth factor binding protein related p

3、rotein 1,IGFBPrPI)是一種可溶性的分泌性蛋白質。導師劉立新前期研究發(fā)現(xiàn),IGFBPrPI在肝纖維化和肝硬化患者肝組織中高表達,并且與TGFpi的高表達和膠原合成的增多呈正相關:外源性重組TGFpi作用于體外培養(yǎng)的HSC后,可使IGFBPrPI蛋白的產生增多;抗IGFBPrPI抗體可以抑制TAA誘導的肝纖維化小鼠肝組織中TGFpi的產生。有研究表明,0.05-O.lμg/L濃度的外源性重組TGFβ1作用于兔角膜內皮細胞時,

4、可以促進細胞的增殖,內源性TGFpi基因在兔角膜內皮細胞中過表達后,細胞增殖受到抑制,提示不同來源的TGFβ1對同一細胞的生理作用會有不同的影響。為了明確內源性TGFβ1對肝星狀細胞中IGFBPrPI表達的影響及其可能的意義,設計了本課題。
　　 目的：
　　 明確內源性轉化生長因子(TGF)βl對肝星狀細胞中胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白I(IGFBPrPI)表達的影響及其可能的意義。
　　 方法：
　

5、　 1.轉染效率檢測
　　 使用帶熒光的陰性質粒pEGFP-NI轉染人肝星狀細胞LX-2后48h,熒光顯微鏡下觀察轉染效率。
　　 2.內源性TGFpi基因過表達
　　 將LX-2分為3組:空白對照組:加入等量不含血清及抗生素的RPMl-1640培養(yǎng)液;陰性質粒組:轉染陰性對照質粒;TGFpi過表達組:轉染TGFβl過表達質粒。轉染后不同時間(24h、48h、72h),采用Real-timePCR法檢測TGFβ

6、l、CollagenImRNA的表達;轉染后72h,采用Westemblot法檢測細胞上清液中TGFβl、CollagenI蛋白的表達。
　　 3.內源性TGFpi對IGFBPrP1表達的影響
　　 LX-2分組及處理同前,轉染后不同時間(24h、48h、72h),采用Real-time PCR法檢測IGFBPrPImRNA的表達;轉染后72h,采用Western blot法檢測細胞胞漿中IGFBPrPI蛋白的表達。

7、r>　　 結果：
　　 1.細胞轉染效率
　　 轉染后48h,熒光顯微鏡下觀察,可見綠色熒光,說明轉染成功,計算質粒轉染效率達40％。
　　 2.TGFpi、Collagenl mRNA及蛋白的表達
　　 Real-time PCR檢測結果顯示:轉染后24h,TGFβl過表達組(32.22±0.39)TGFpl mRNA的表達顯著高于空白對照組(1)及陰性質粒組(7.98±0.12),差異有統(tǒng)計學意義(

8、P＜O.OI),TGFpi過表達組(1.92±0.04)CollagenI mRNA的表達與陰性質粒組(1.99±0.07)差別不明顯（P＞0.05）;轉染后48h,TGFβ1過表達組(63.12+0.44)TGFpi mRNA的表達顯著高于空白對照組(1)及陰性質粒組(l.Ol±0.01),TGFpi過表達組(2.00±0.06)CollagenI mRNA的表達顯著高于空白對照組(l)及陰性質粒組(1.02±0.01),差異均有統(tǒng)計

9、學意義（P值均＜0.01）;轉染后72h,TGFpi過表達組(38.46±0.19)TGFpi mRNA的表達顯著高于空白對照組(1)及陰性質粒組(1.05±0.01),TGFpi過表達組(8.63+0.15)CollagenI mRNA的表達顯著高于空白對照組(1)及陰性質粒組(1.03±0.02),差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01)。Western blot檢測結果顯示:轉染后72h,TGFβl過表達組(0.27±0.04)TG

10、Fpi蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.20βO.OI)及陰性質粒組(0.22β0.01),TGFpi過表達組(1.47±0.02)CollagenI蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.76±0.03)及陰性質粒組(0.77±0.02),差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)。
　　 3.IGFBPrPI mRNA及蛋白的表達
　　 Real-time PCR檢測結果顯示:轉染后24h,TGFpi過表達組(4.33±0.3

11、8)IGFBPrPI mRNA的表達顯著高于空白對照組(l)及陰性質粒組（2.86±0.09）;轉染后48h,TGFpi過表達組(1.4l±O.11)IGFBPrPI mRNA的表達顯著高于空白對照組(1)及陰性質粒組（1.07±0.16）;轉染后72h,TGFβl過表達組(2.56±0.30)IGFBPrPI mRNA的表達顯著高于空白對照組(l)及陰性質粒組(l.Oo±0.10),差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.Ol)。Wester

12、n blot檢測結果顯示:轉染后72h,TGFpi過表達組(0.53±O.OI)IGFBPrPI蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.25±0.02)及陰性質粒組(0.27±0.03),差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 結論：
　　 內源性TGFpi可引起LX-2過表達TGFβl和CollagenI mRNA及蛋白,同時亦可以增加IGFBPrPI mRNA及蛋白的表達。推測IGFBPrPI與致肝纖維化最強的因子TGF