羅格列酮對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化肝星狀細(xì)胞活化及PPARγ、TGFβ1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝纖維化是在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的基礎(chǔ)上，各種纖維化相關(guān)因子激活導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化及表型轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)而形成的。非酒精性脂肪性肝纖維化是NASH進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌的必經(jīng)階段，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，因此，亦缺乏有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療

2、措施，目前有關(guān)非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍關(guān)注。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)屬于甾體激素類受體超家族中的細(xì)胞核受體家族成員，人體內(nèi)PPARγ在肝臟、肌肉均有表達(dá)，PPARγ在脂肪性肝炎/肝纖維化發(fā)病中的作用及其機(jī)制目前尚未明確，目前認(rèn)為PPARγ是維持IISCs靜息狀態(tài)的重要細(xì)胞因子，推測(cè)

3、PPARγ激活可能具有逆轉(zhuǎn)活化HSCs恢復(fù)靜息狀態(tài)而阻止或延緩肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。羅格列酮為PPARγ的特異性激動(dòng)劑，可通過(guò)激活PPARγ實(shí)現(xiàn)抗炎、抗纖維化等多種生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)采用高脂、蛋氨酸-膽堿缺乏(high fat，methionine-choline deficient diet，MCD)飲食建立小鼠脂肪性肝纖維化模型，應(yīng)用PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮進(jìn)行干預(yù)治療，以免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)HSCs活化標(biāo)志-α-平滑肌肌動(dòng)蛋

4、白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)表達(dá)變化；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot方法研究PPARγ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)在脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中的表達(dá)情況及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系，并觀察羅格列酮干預(yù)后PPARγ及TGFβ

5、1表達(dá)變化，以明確PPARγ及TGFβ1在脂肪性肝纖維化發(fā)病中的作用，探討羅格列酮延緩或阻止肝纖維化發(fā)生和進(jìn)展的作用及其機(jī)制，為臨床有效治療非酒精性脂肪性肝纖維化提供理論依據(jù)。方法：選用8周齡健康雄性C57BL6/J小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。模型組采用MCD飼料，對(duì)照組給予膽堿、蛋氨酸充足的飼料，羅格列酮干預(yù)組應(yīng)用MCD飼料加羅格列酮(50mg/kg/d)，共喂養(yǎng)8周。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotran

6、sferase，ALT)，甘油三酯(triglyceride，TG)采用日本Olympus AU 2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；采用蘇丹IV染色、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變；肝組織α-SMA表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)；PPARγ、TGFβ1 mRNA和蛋白表達(dá)分別采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)。 結(jié)果： 1.動(dòng)物一般情況：對(duì)照組

7、小鼠活潑、毛發(fā)有光澤，體重逐漸增加。模型組和羅格列酮干預(yù)組小鼠體重均下降，尤以模型組明顯。對(duì)照組、模型組和干預(yù)組小鼠體重、肝濕重分別為：38.00±0.60 g、17.60±0.89 g、18.25±0.50 g，1.37±0.35g、0.70±0.07 g、0.73±0.05 g。模型組、羅格列酮干預(yù)組小鼠體重、肝濕重較對(duì)照組明顯下降(P值均<0.05)，而羅格列酮干預(yù)組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。對(duì)照組、模型組和干預(yù)組

8、小鼠肝臟指數(shù)分別為：3.6±0.8、4.0±0.2、4.0±0.2，各組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2 血清生化學(xué)改變：對(duì)照組、模型組和干預(yù)組小鼠血清ALT、TG水平依次為：49.67±7.64U/L、591.50±71.60 U/L、270.70±85.05 U/L：0.76±0.29 mmol/L、0.34±0.81 mmol/L、0.47±0.18 mmol/L。模型組小鼠血清ALT顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而羅格列

9、酮干預(yù)后可明顯降低ALT水平(P<0.01)。各組小鼠血清TG水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3.肝臟病理學(xué)變化：肉眼觀察：對(duì)照組小鼠肝臟為紅褐色，明亮有光澤。模型組小鼠肝臟體積明顯減小，整個(gè)肝臟呈淺黃色，與周圍組織有粘連，切面油膩、無(wú)光澤。羅格列酮干預(yù)組小鼠肝臟體積亦有縮小，為紅褐色、有光澤。光鏡觀察：對(duì)照組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝板排列整齊；模型組肝細(xì)胞彌漫性水樣變，呈現(xiàn)大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變，以腺泡3帶明顯，小葉內(nèi)

10、可見點(diǎn)狀或灶狀肝細(xì)胞壞死伴以單個(gè)核細(xì)胞為主的混合性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少量分葉核白細(xì)胞。匯管區(qū)及竇周可見大量纖維組織增生，形成纖維間隔分割肝小葉(F3～4G2～3S3～4)。羅格列酮干預(yù)組小鼠肝損傷較模型組明顯減輕，脂肪變肝細(xì)胞明顯減少，炎癥、壞死及纖維化程度明顯減輕(F0～1G1～2S1)。 4 肝組織α-SMA的表達(dá)變化：對(duì)照組小鼠肝組織α-SMA僅在小動(dòng)脈壁上有表達(dá)：與對(duì)照組相比，模型組肝臟α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，大量H

11、SCs胞漿表達(dá)α-SMA(0.50±0.05vs.1.57±0.05，P<0.01)；羅格列酮干預(yù)組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少(1.57±0.05 vs.1.07±0.06，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5 肝組織PPARγ mRNA的表達(dá)：與對(duì)照組相比，模型組PPARγ mRNA表達(dá)明顯下降(0.73±0.17 vs.0.53±0.08，P<0.05)，而羅格列酮干預(yù)組表達(dá)較模型組明顯上調(diào)(0.53±0.08vs.0

12、.71±0.14，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6 肝組織PPARγ蛋白表達(dá)情況：與對(duì)照組相比，模型組PPARγ蛋白表達(dá)明顯下降(0.39±0.01 vs.0.27±0.01，P<0.05)，而羅格列酮干預(yù)組表達(dá)較模型組明顯增加(0.27±0.01 vs.0.57±0.01，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 7 肝組織TGFβ1 mRNA表達(dá)情況：與對(duì)照組相比，模型組TGFβ1 mRNA表達(dá)顯著增加(0.32

13、±0.01 vs.0.89±0.01，P<0.01)，而羅格列酮干預(yù)組表達(dá)較模型組明顯下降(0.89±0.01 vs.0.46±0.05，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 8 小鼠肝組織TGFβ1蛋白表達(dá)情況：與對(duì)照組相比，模型組TGFβ1蛋白表達(dá)顯著增加(0.55±0.01 vs.1.15±0.00，P<0.01)，而羅格列酮干預(yù)組表達(dá)較模型組明顯下降(1.15±0.00vs.0.93±0.01，P<0.05)，差異具有統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.高脂、蛋氨酸-膽堿缺乏飲食8周可誘導(dǎo)典型的非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型，此模型造模時(shí)間短，模型復(fù)制率高，病理改變符合人類脂肪性肝纖維化特點(diǎn)。 2.脂肪性肝纖維化模型中肝組織活化的HSCs明顯增多，PPARγ表達(dá)明顯減少，推測(cè)減少的PPARγ不能維持HSCs靜息狀態(tài)而致活化的HSCs數(shù)量增多，參與肝纖維化形成。模型組小鼠肝臟TGFβ1表達(dá)明顯增加，具有促進(jìn)HSCs活化及肝纖維化形成的作用。