非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中異常表達(dá)miRNAs的鑒定及功能研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確因素所致的以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝(simple fattyliver，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化及相關(guān)肝硬

2、化。其中，NASH為該病進(jìn)展的重要病理階段，以肝細(xì)胞脂肪變伴有壞死性炎癥和/或纖維化為主要特征，進(jìn)一步可進(jìn)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌。
　　近年來，隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年增高，并趨于年輕化。NAFLD患病率為歐美及澳大利亞等發(fā)達(dá)國家慢性肝病的首位，也是肝酶學(xué)異常的首要病因，普通人群患病率高達(dá)20％～40％。亞太地區(qū)NAFLD患病率為12％～24％，其中1/3～1/2為NASH，后者有15％～25％在10

3、年內(nèi)可進(jìn)展為肝硬化，而非酒精性脂肪性肝硬化患者原發(fā)性肝細(xì)胞癌、肝功能衰竭的發(fā)生率高達(dá)30％～40％。近年來我國NAFLD患病率逐年上升，城市人口患病率達(dá)15.35％～31.3％。據(jù)2010年城市人口健康調(diào)查結(jié)果，男性脂肪肝患病率為19％，女性為15％，分別為危害健康第一位和第九位的危險因素。南月敏等對健康體檢的綜合醫(yī)院醫(yī)務(wù)工作者連續(xù)隨訪5年，患病率達(dá)31.6％。朗振為等對不明原因肝炎病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NASH占15.5％。NAFLD已成為危

4、害人類健康和生活質(zhì)量的主要肝臟疾病之一。非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化為NAFLD進(jìn)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，目前非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，亦缺乏準(zhǔn)確判斷病情的指標(biāo)及特異有效的防治措施，對于非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機(jī)制、基因診斷標(biāo)志及治療新靶點的探索十分必要和迫切。
　　MicroRNAs(miRNAs)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子在肝臟的生成、分化及代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Sanyal等發(fā)現(xiàn)在NASH患者

5、肝組織中miR-34a和miR-146b表達(dá)上調(diào)、miR-122下調(diào)。其中，miR-122可通過負(fù)性調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol ResponsiveElement Binding Protein-1c，SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acidsynthetase，F(xiàn)AS)和HMG-CoA還原酶(HMG CoA reductase，HMGCR)的表達(dá)，參與肝細(xì)胞脂肪酸的生物合成過程。而miR-33a與miR

6、-33b也可通過調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Responsive Element BindingProtein，SREBP)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與膽固醇和脂肪代謝的調(diào)控。miR-34a通過抑制?；o酶A合成酶長鏈家族成員1（acyl-CoA synthetaselong-chain family member1，ACSL1）的表達(dá)、去乙酰化酶-1的表達(dá)調(diào)控腺苷一磷酸激酶(AMP kinase)和HMG-CoA還原酶的脫磷酸化，

7、參與膽固醇的生物合成過程。另外，miR-467b通過負(fù)性調(diào)控其靶蛋白肝臟脂蛋白酶表達(dá)，減少游離脂肪酸的生成，參與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)導(dǎo)致脂質(zhì)沉積過程的調(diào)控。miR-103與miR-107可通過調(diào)控其靶基因胰島素受體小窩蛋白-1(Caveolin-1，CAV1)，調(diào)節(jié)胰島素敏感性、維持血糖平衡。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，特定的miRNAs可能參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展，但其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　

8、　本研究首先應(yīng)用膽堿-蛋氨酸缺乏(methionine and choline deficience，MCD)飲食8周建立非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測小鼠肝組織中miRNAs表達(dá)譜的變化;采用實時定量PCR方法驗證各組小鼠肝組織中差異表達(dá)的miRNAs，篩選與非酒精性脂肪性肝纖維化有關(guān)表達(dá)變化最明顯的miRNA;通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNA的靶基因，進(jìn)行功能分類和信號通路預(yù)測;采用實時定量PCR及wester

9、nblot方法檢測miRNA靶基因及靶蛋白在非酒精性肝纖維化小鼠肝組織中的表達(dá)變化。構(gòu)建含有目標(biāo)miRNA靶基因3'-UTR的報告載體，采用熒光素酶實驗(Luciferase Reporter Assay)進(jìn)一步驗證miRNA對其靶基因的調(diào)控作用。靶向調(diào)控LX-2細(xì)胞中關(guān)鍵miRNA表達(dá)，觀察非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵基因表達(dá)變化，深入闡明miRNAs在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病過程中的作用、其作用的靶基因及主導(dǎo)分子信號通路，為非酒

10、精性脂肪性肝纖維化的臨床防治提供新的靶點及依據(jù)。
　　第一部分、非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中異常表達(dá)miRNAs的篩選與驗證
　　目的:篩選非酒精性脂肪性肝纖維化形成過程中異常表達(dá)的miRNAs。
　　方法:采用MCD飲食喂養(yǎng)6～7周齡清潔級健康雄性C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，以膽堿蛋氨酸充足飼料喂養(yǎng)對照組小鼠。酶聯(lián)免疫法測定小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotra

11、nsferase，ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)的水平;HE及Masson染色觀察肝臟組織脂肪變性、炎癥活動及纖維化程度，并進(jìn)行組織學(xué)評分;應(yīng)用Qiagen公司的MiRNeasy Mini Kit試劑盒提取部分新鮮肝臟組織的總RNA，分光光度計測定RNA質(zhì)量，1％瓊脂糖凝膠電泳測定RNA純度，采用AffymetrixmiRNA基因表達(dá)譜芯片GeneChip miRNA2.0

12、Array進(jìn)行雜交，進(jìn)行miRNAs基因芯片檢測，篩查在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中異常表達(dá)的miRNAs并進(jìn)行實時定量PCR驗證。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況:造模過程中，對照組小鼠活潑，毛發(fā)有光澤，體重逐漸增加;MCD模型組小鼠精神萎靡，少動，毛發(fā)紊亂、無光澤，攝食明顯減少，體重增長緩慢，隨著時間推移，模型組小鼠出現(xiàn)被毛脫落現(xiàn)象。
　　2.肝指數(shù)變化:MCD模型組小鼠體重顯著低于對照組(P＜0.05)，肝濕

13、重較對照組無明顯變化(P＞0.05)，肝指數(shù)（肝濕重/體重×100％）較對照組明顯升高(P＜0.05)。
　　3.各組小鼠血生化指標(biāo)的結(jié)果:MCD組血清中ALT及AST的水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.各組小鼠肝組織HE及Masson染色的結(jié)果:MCD組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性，并伴點狀和灶狀壞死、炎性細(xì)胞浸潤、匯管區(qū)纖維組織增生及竇周纖維化等。
　　5.miRNAs芯片結(jié)果:與對照組

14、相比，MCD模型組有47個差異表達(dá)的miRNAs（P＜0.05），其中15個變化在2倍之上。mmu-let-7i、mmu-mir-155、mmu-mir-199a-5p、 hsa-mir-34a、 mmu-mir-221、mmu-mir-200c、mmu-mir-297c、 mmu-mir-713、mmu-mir-190b、mmu-mir-678，10個miRNAs在MCD模型組的肝臟組織中表達(dá)明顯上調(diào);mmu-mir-122、mmu-

15、mir-103、mmu-mir-146、mmu-mir-101a、mmu-mir-466j,5個miRNAs在MCD模型組的肝臟組織中表達(dá)明顯下調(diào)。
　　6.綜合本實驗基因芯片結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報道，選擇miR-122、miR-221及miR-199a-5p進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR驗證，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，MCD組小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達(dá)明顯增高、miR-122明顯降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:<

16、br>　　1.在MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型中，肝組織miRNAs表達(dá)譜明顯改變，表明差異表達(dá)的miRNAs參與非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　2.miR-199a-5p可能為非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控基因之一。
　　第二部分、miR-199a-5p生物信息學(xué)分析及靶基因驗證
　　目的:探討miR-199a-5p在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病中可能的作用及其潛在的作用靶點

17、。
　　方法:動物分組及標(biāo)本取得同第一部分。應(yīng)用TargetScan6.2、miRanda及PITA軟件共同預(yù)測miR-199a-5p的靶基因，應(yīng)用DAVID軟件分析miR-199a-5p可能的生物學(xué)功能及參與調(diào)節(jié)的信號通路。采用實時熒光定量RT-PCR及Western blot法分析在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中miR-199a-5p靶基因mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)分析結(jié)

18、果:GO分析結(jié)果顯示，miR-199a-5p參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物組成、絲蘇氨酸蛋白激酶活化等多種生物學(xué)調(diào)控;KEGG分析顯示，miR-199a-5p參與胰島素信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路等多條通路的調(diào)控。
　　2.miR-199a-5p的靶基因預(yù)測:應(yīng)用三種miroRNA靶基因預(yù)測軟件(TargetScan、PITA和miRanda)共同預(yù)測miR-199a-5p的靶基因，得到26個與miR-199a-5p

19、相關(guān)的基因。
　　3.各組小鼠肝臟組織中miR-199a-5p靶基因核受體共抑制劑1(nuclear receptor corepressor，NCOR1)的表達(dá)情況:與對照組相比，MCD組肝組織中NCOR1蛋白的表達(dá)明顯減少(p＜0.05)，與miR-199a-5p的表達(dá)負(fù)相關(guān);模型組與對照組肝組織NCOR1 mRNA表達(dá)無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.生物信息學(xué)分析結(jié)果示，miR-199a-5p參與胰島素信號通路

20、、Wnt信號通路、MAPK信號通路等多條與非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號通路的調(diào)控。
　　2.在MCD飲食誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，miR-199a-5p可能通過調(diào)控NCOR1蛋白的表達(dá)參與疾病的發(fā)生與進(jìn)展。
　　第三部分、mi-199a-5p與其靶基因NCOR1的相互作用機(jī)制
　　目的:驗證miR-199a-5p與NCOR13'-UTR靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　方法:根據(jù)Gene Bank公布的人NCOR1基因3

21、'-UTR序列設(shè)計含有miR-199a-5p結(jié)合位點的NCOR13'-UTR PCR引物，并在引物中加入NotⅠ和XhoⅠ兩個限制性酶切位點。將擴(kuò)增的NCOR13'-UTR序列插入攜帶螢火蟲熒光與海腎熒光雙熒光報告基因的psiCHECKTM-2質(zhì)粒的XhoⅠ和NotⅠ位點之間，構(gòu)建NCOR13'-UTR-luciferase報告載體，將NCOR13'-UTR-luciferase報告載體與pre-miR-199a-5p共同轉(zhuǎn)染至HEK2

22、93細(xì)胞，48 h后檢測熒光強(qiáng)度，并計算螢火蟲熒光與海腎熒光的比值。分析miR-199a-5p對NCOR1的靶向調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.查詢“Ensembl Mouse database”，得到全長2202 bp的NCOR13'-UTR序列，其中，在NCOR13'-UTR的790 bp～796 bp處存在可能與miR-199a-5p結(jié)合的位點。
　　2.從血液中提取基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0％

23、的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳顯示出一條約2000 bp特異性片段，實驗與預(yù)期結(jié)果相符。重組質(zhì)粒p3'UTR-NCOR1經(jīng)上海生工進(jìn)一步測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　3.將構(gòu)建的p3'UTR-NCOR1質(zhì)粒與pre-miR-199a-5p或陰性對照序列共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，48h后檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-199a-5p可以直接作用于NCOR13'-UT序列，并可抑制熒光素酶活性。。
　　結(jié)論:miR-19

24、9a-5p可靶向作用于NCOR13'-UTR，負(fù)性調(diào)控NCOR1的表達(dá)。
　　第四部分、miR-199a-5p靶向調(diào)控對LX-2細(xì)胞活力與功能的影響
　　目的:靶向調(diào)控LX-2細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)，觀察非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵基因表達(dá)變化，深入闡明miRNAs在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病過程中的作用、其作用的靶基因及主導(dǎo)分子信號通路，為非酒精性脂肪性肝纖維化的臨床防治提供新的靶點及科學(xué)依據(jù)。
　　方法

25、:應(yīng)用人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞，培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5％ CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60％左右時，用不同濃度miR-199a-5p的模擬物及抑制劑轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，采用MTT法測定各組細(xì)胞活力，選擇合適的轉(zhuǎn)染濃度。采用實時熒光定量PCR及Western-blot法分析miR-199a-5p及其靶基因NCOR1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。同時應(yīng)用We

26、stern-blot方法觀察miR-199a-5p對非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵因子的影響。
　　結(jié)果:
　　1.MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染不同濃度的對照序列對LX-2細(xì)胞活力無明顯影響;轉(zhuǎn)染100nM及150nM的miR-199a-5p模擬物后，LX-2細(xì)胞活力明顯降低，而轉(zhuǎn)染50nM的模擬物，則無明顯變化;轉(zhuǎn)染100nM及150nM的miR-199a-5p抑制劑后，LX-2細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，而50 nM的miRNA抑制劑則對

27、細(xì)胞活力無明顯影響;
　　2.各轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組LX-2細(xì)胞相比，miR-199a-5p的表達(dá)量有不同程度改變，miR-199a-5p靶基因NCOR1 mRNA的表達(dá)量則無明顯變化。與未轉(zhuǎn)染組比較，NC組miR-199a-5p的表達(dá)量無明顯變化，Mimic組miR-199a-5p的表達(dá)量顯著增高(P＜0.01)，Inhibitor組miR-199a-5p表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）;
　　3.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-199a-5

28、p靶蛋白NCOR1及過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)蛋白的表達(dá)量有不同程度改變，與未轉(zhuǎn)染組比較，NC組NCOR1和PPARγ蛋白的表達(dá)量均無明顯變化，Mimic組NCOR1蛋白的表達(dá)量顯著降低，PPARγ蛋白的表達(dá)量明顯增高(P＜0.05)，Inhibitor組NCOR1蛋白表達(dá)量明顯增高，PPARγ蛋白的表達(dá)量則降低(P＜0.0

29、5)。PPARγ蛋白與轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞中NCOR1蛋白的表達(dá)變化相反;
　　4.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞肝纖維化相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowth factor beta，TGFβ1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)量有不同程度改變，與未轉(zhuǎn)染組比較，NC組TGF-β1及α-SMA蛋白的表達(dá)量無明顯變化，Mimic組TGF-β1及α-SMA蛋白的表達(dá)量顯著降低(P＜0.0

30、5)，Inhibitor組TGF-β1及α-SMA蛋白表達(dá)量明顯增高(P＜0.05)。TGF-β1及α-SMA蛋白與轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞中NCOR1蛋白的表達(dá)變化一致。
　　結(jié)論:
　　1.轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物或抑制劑可引起LX-2細(xì)胞活力的改變，提示miR-199a-5p可能通過影響HSC細(xì)胞增殖及活化參與非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病過程。
　　2.miR-199a-5p可能通過負(fù)性調(diào)控NCOR1蛋白表達(dá)影響PP