羅格列酮對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織ⅠκB激酶β表達(dá)的作用研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一種獲得性代謝疾病，多由單純性脂肪肝發(fā)展而來，當(dāng)炎癥持續(xù)存在，可發(fā)展為肝纖維化甚至肝硬化，是隱源性肝硬化的重要原因之一。IKK激酶復(fù)合物(Inhibit kappaB kinase complex，IKKs)屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶超家族成員，主要由三個亞單位組成：兩個催化亞基IкB激酶β(inhibit kappa B

2、kinase beta，IKKβ)和IкB激酶α(inhibit kappa B kinase alpha，IKKα)，一個調(diào)節(jié)亞基IкB激酶γ(inhibit kappa B kinase gamma，IKKγ/NEMO)。其中IKKβ是核因子-кB(nuclear factor-kappa B，NF-кB)激活所必需的，它參與炎癥相關(guān)基因及抗凋亡基因的表達(dá)。最新的研究表明，它在肝臟、結(jié)腸、肺臟、骨組織中有表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、

3、胰島素抵抗、脂肪肝、急性肝損傷等病理過程和疾病關(guān)系密切，但分子機制不清。曾民德報道胰島素抵抗和脂肪組織脂解增高是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)。羅格列酮為噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，其通過激活靶組織中的過氧化酶體增殖激活受體γ(peroxisomeproliferators-activated receptor gamma，PPARy)，來提高靶組織的胰

4、島素敏感性，改善胰島素抵抗。本文旨在探討IKKβ在NASH病理變化機制中的作用及PPARγ配體羅格列酮的影響效應(yīng)，為了解NASH的發(fā)病機制和治療提供依據(jù)。 方法：選用雄性健康清潔級Wistar大鼠38只，體重140±10g，正常飼養(yǎng)一周后，隨機分為正常對照組10只和高脂飲食組28只。正常對照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料；高脂組在標(biāo)準(zhǔn)飼料的基礎(chǔ)上加入10％豬油、2％膽固醇和5％玉米油。于第16周股靜脈放血處死正常對照組大鼠2只和高脂飲食組大鼠4

5、只，觀察肝臟的顏色、質(zhì)地，留取肝組織標(biāo)本，經(jīng)HE巳染色證實NASH大鼠模型形成。正常對照組余8只大鼠繼續(xù)給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組另24只隨機分為模型對照組、高劑量治療組(羅格列酮4mg/kg·d)、低劑量治療組(羅格列酮1mg/kg·d)，每組各8只，于28周末一并處死四組大鼠共32只，留取血清，以備血清學(xué)檢查。取肝右葉組織3塊，分別用于快速冰凍切片，行SudanⅣ染色，觀察肝細(xì)胞脂變情況；10％的甲醛固定用于HE染色及Masson

6、染色，觀察肝組織的炎癥、脂肪變性及纖維化程度；4％多聚甲醛固定用于IKKβ免疫組化染色，觀察肝組織IKKβ的表達(dá)；余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)觀察大鼠肝組織IKKβ mRNA的表達(dá)。 用日本Olympus AU2700全自動生化分析儀檢測血清膽固醇(cholesterol，TC)，甘油三酯

7、(triglyceride，TG)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)；用ELISA雙抗體夾心法測定血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNF-α)表達(dá)量。}玎巳染色觀察肝組織普通病理變化；SudanⅣ染色觀察肝細(xì)胞脂變的程度；Masson三重染色觀察肝纖維化程度；采用Pow

8、er Envision兩步法對肝組織標(biāo)本進(jìn)行IKKβ免疫組化染色。用多功能圖像分析儀測定IKKβ表達(dá)面積百分比，每張切片取四周及中央五個區(qū)域，20倍物鏡下計算平均面密度(陽性面積與統(tǒng)計場面積百分比)，結(jié)果取平均值。用SAS10.0統(tǒng)計軟件處理所有數(shù)據(jù)，計量資料采用x±s表示，采用單因素方差分析前進(jìn)行方差齊性檢驗，Student-Newman-Keuls法進(jìn)行組間比較。相關(guān)性分析用直線相關(guān)分析法。 結(jié)果：1大鼠的一般表現(xiàn)：正常對照

9、組大鼠皮毛有光澤、活潑，體重逐漸增加，模型組較正常對照組大鼠體重增加明顯，治療組大鼠體重增加減慢。28周末，正常大鼠肝臟外觀呈紅褐色，明亮有光澤；模型組大鼠肝臟顏色呈淺黃或土黃色，切面油膩感，無光澤。治療組大鼠肝臟顏色呈淡黃色，較有光澤。 2 血清學(xué)指標(biāo)的變化：與正常對照組相比，模型組大鼠血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平顯著增高(

10、P<0.01)；與模型組相比，治療組血清生化指標(biāo)及TNF-αc水平顯著下降(P<0.01)。 3 肝組織病理學(xué)變化及免疫組織化學(xué)：光鏡下，正常對照組大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，SudanⅣ染色肝細(xì)胞胞漿呈天藍(lán)色，Masson三重染色示中央靜脈及匯管區(qū)未見明顯膠原纖維。模型對照組大鼠肝細(xì)胞均出現(xiàn)中、重度的脂肪變性，伴有小葉內(nèi)炎癥及匯管區(qū)炎癥，還有點狀或灶狀壞死，部分出現(xiàn)竇周及中央靜脈纖維化，SudanⅣ染色可見脂變的肝

11、細(xì)胞胞漿中有密布散在的紅色顆粒，肝細(xì)胞內(nèi)有不同程度炎癥。治療組呈現(xiàn)脂變及炎癥程度顯著減低，未見明顯纖維化。正常對照組大鼠肝組織免疫組化染色可見IKKβ在胞漿有弱表達(dá)，表達(dá)部位呈淺黃色，IKKβ相對含量為6.78±8.87。與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織表達(dá)IKKβ的肝細(xì)胞數(shù)明顯增多，且主要表達(dá)在肝細(xì)胞核，陽性部位呈深棕黃色，IKKβ相對含量為47.93±11.72。與模型對照組相比，治療組大鼠肝組織IKKβ表達(dá)的相對含量顯著降低為3

12、3.68±6.74，以高劑量治療組的變化為著為20.65±5.91(P<0.01)。 4 相關(guān)性分析：各組大鼠肝組織IKKβ mRNA表達(dá)與血清TNF-α水平呈正相關(guān)(r值分別為0.940、0.762、0.973、0.947，P值分別為<0.01、<0.05、<0.01、<0.01)，模型組與高劑量治療組IKKβ mRNA表達(dá)與血清ALT、AST水平正相關(guān)(r值分別為0.772、0.810、0.720、0.842，P值分別為<0

13、.05、<0.05、<0.05、<0.01)。 結(jié)論：1 應(yīng)用高脂飲食的方法可以成功制備NASH大鼠模型，脂代謝紊亂是NASH發(fā)生和發(fā)展的重要機制。 2 模型組大鼠肝組織IKKβ表達(dá)、血清TNF-α水平顯著高于正常對照組，與血清ALT、AST水平呈正相關(guān)，而與肝纖維化程度無關(guān)。表明NASH發(fā)病機制中IKKβ促進(jìn)TNF-α釋放，導(dǎo)致IKKβ-TNF-α惡性循環(huán)，促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。 3 治療組大鼠肝組織IKK