微生態(tài)制劑對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟NKT細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是以肝細(xì)胞脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥伴灶性壞死為特征的一類(lèi)遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性臨床病理綜合征。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。肝臟固有免疫及環(huán)境遺傳等多種因素可能共同參與NASH的發(fā)生進(jìn)展。目前微生態(tài)制劑作為臨床輔助治療肝臟病的藥物應(yīng)用較為廣泛,但其對(duì)NASH的治療作用尚不明確。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠建立NASH大鼠模型,并應(yīng)用微生

2、態(tài)制劑-雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌給予大鼠灌胃,觀察該藥物對(duì)NASH大鼠肝損傷中肝組織CD1d、NKT細(xì)胞及CXCL16等指標(biāo)及腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-12等Th1型細(xì)胞因子水平的影響,旨在探討該藥物在NASH中可能的治療作用及其作用機(jī)制。
　　 方法:36只雄性健康Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照A組(造模0周)、正常對(duì)照B組、高脂飲食8周、

3、12周、16周組及雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌治療組。分別于造模0周、8周、12周、16周處死大鼠取材。并行HE、SudanⅣ、Masson染色,觀察肝組織炎癥、脂肪變性及纖維化程度；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)觀察肝組織CXCL16 mKNA、CD1d mRNA表達(dá)；免疫組織化學(xué)觀察CXCL16蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝組織NKT細(xì)胞百

4、分含量；全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清生化學(xué)指標(biāo)；酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定血清TNF-α、IL-12水平。
　　 結(jié)果:
　　 1一般表現(xiàn):正常對(duì)照組大鼠皮毛有光澤、食欲佳,精神狀態(tài)好,體重逐漸增加；高脂組大鼠精神萎靡,活動(dòng)減少,食欲減退,皮毛欠光澤,體重增加明顯；治療組大鼠精神、食欲及活動(dòng)介于正常對(duì)照組與高脂組之間。
　　 2血清學(xué)指標(biāo)的變化

5、r>　　 2.1血清學(xué)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化
　　 高脂8周、12周、16周組大鼠血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平均較正常對(duì)照A組顯著升高(P均<0.01),且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高；血清TNF-α水平:高脂8周、12周、16周組分別為11.39±2.59、21.2±5.18、28.23±4.31,均較正常對(duì)照A組(5.92±1.68)顯著升高(P均<0.01)；I

6、L-12水平:高脂8周、12周、16周組分別為49.493±8.024、68.392±7.302、78.957±12.434,均較正常對(duì)照A組(34.256±7.518)顯著升高(P均<0.01),以上結(jié)果表明隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),大鼠血清TNF—α、IL-12水平逐漸升高。
　　 2.2微生態(tài)制劑對(duì)血清學(xué)指標(biāo)的影響
　　 高脂16周組TC、TG、ALT、AST等指標(biāo)分別為3.89±0.22、0.93±0.26、103.37

7、±20.11、154.82±17.59,較正常對(duì)照B組上述各指標(biāo)(1.87±0.19、0.55±0.25、35.38±12.47、73.54±10.63)均顯著升高(P均

8、.01)；IL-12水平:治療組血清IL-12水平是37.562±7.557,顯著低于高脂16周組(78.957±12.434)(P<0.01)。
　　 3肝組織病理變化:肉眼觀察,正常對(duì)照組大鼠肝臟外觀為紅褐色,有光澤,質(zhì)軟；高脂組大鼠肝臟體積明顯增大,顏色為淺黃色,切面油膩感；治療組大鼠肝臟外觀介于正常對(duì)照組和高脂組之間。光鏡下,HE染色示正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞索以肝小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝索結(jié)構(gòu)整齊；SudanⅣ染

9、色示肝細(xì)胞無(wú)脂肪滴,胞漿呈藍(lán)色；Masson三重染色示中央靜脈及匯管區(qū)未見(jiàn)明顯膠原纖維沉積。HE、SudanⅣ染色示高脂8周組大鼠部分肝細(xì)胞氣球樣變,胞漿內(nèi)充滿(mǎn)大量粉紅色脂滴,脂變的肝細(xì)胞以中央靜脈周?chē)顬槊黠@,中央靜脈周?chē)梢?jiàn)點(diǎn)狀壞死；高脂12周組可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹程度加重,胞漿內(nèi)粉紅色脂滴增多,中央靜脈周?chē)醒装Y細(xì)胞浸潤(rùn),炎性細(xì)胞以單個(gè)核細(xì)胞為主,可見(jiàn)灶性壞死；高脂16周組大鼠肝細(xì)胞彌漫性脂肪變,可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)充滿(mǎn)粉紅色脂滴,小葉內(nèi)彌漫性

10、肝細(xì)胞點(diǎn)、灶性壞死；治療組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)粉紅色脂滴明顯減少,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。Masson三重染色示高脂8周組、12周組大鼠肝組織中央靜脈、匯管區(qū)均未見(jiàn)明顯膠原纖維；高脂16周組大鼠肝組織可見(jiàn)肝竇周?chē)z原纖維沉積；治療組大鼠中央靜脈、匯管區(qū)無(wú)明顯膠原纖維沉積。
　　 4流式細(xì)胞儀測(cè)定肝臟NKT細(xì)胞的百分含量
　　 4.1肝臟NKT細(xì)胞的百分含量的動(dòng)態(tài)變化
　　 高脂8周、12周、16周組肝臟NKT細(xì)胞百分比分別

11、為(17.48±2.43)％、(15.08±1.81)％、(8.31±3.81)％,較正常對(duì)照A組肝臟NKT細(xì)胞百分比(25.26±2.56)％顯著降低(P均<0.01),肝臟NKT百分比隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P均<0.01)。
　　 4.2微生態(tài)制劑對(duì)肝臟NKT細(xì)胞百分比的影響
　　 高脂16周組肝臟NKT細(xì)胞百分比(8.31±3.81)％較正常對(duì)照B組(22.94±2.65)％顯著降低；經(jīng)微生態(tài)治療后,肝臟NKT

12、細(xì)胞百分比為(16.90±1.96)％,較治療前顯著升高(P<0.01)。
　　 5 RT-PCR檢測(cè)CD1d mRNA、CXCL16 mRNA在大鼠肝組織的表達(dá)
　　 5.1大鼠肝組織CD1dmRNA、CXCL16 mRNA的動(dòng)態(tài)變化
　　 大鼠肝組織CD1d mRNA表達(dá):正常對(duì)照A組、高脂8周、12周、16周組大鼠肝組織CD1d mRNA相對(duì)含量分別為0.640±0.040、0.579±0.027、0.50

13、7±0.023、0.447±0.037,表明隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),大鼠肝組織CD1d mRNA表達(dá)顯著下降(P均<0.01)；CXCL16 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示,正常對(duì)照A組、高脂8周、12周、16周組大鼠肝組織CXCL16 mRNA相對(duì)含量分別為0.215±0.031、0.364±0.032、0.529±0.046、0.586±0.016,表明隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),CXCL16 mRNA顯著升高(P均<0.01)。
　　 5.2微生態(tài)

14、制劑對(duì)大鼠肝組織CD1d mRNA、CXCL16 mRNA表達(dá)影響
　　 高脂16周組大鼠肝組織CD1d mRNA的相對(duì)含量為0.447±0.037,較正常對(duì)照B組(0.666±0.027)顯著降低；治療組大鼠肝組織CD1d mRNA相對(duì)含量為(0.559±0.044),較治療前顯著升高(P<0.01)；高脂16周組大鼠肝組織CXCL16 mRNA相對(duì)含量為0.586±0.016,較正常對(duì)照B組(0.217±0.034)顯著升高

15、；治療組大鼠肝組織CXCL16 mRNA相對(duì)含量為0.375±0.035,較治療前顯著降低(P<0.01)。
　　 6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CXCL16蛋白在大鼠肝組織的表達(dá)
　　 6.1大鼠肝組織CXCL16的動(dòng)態(tài)變化
　　 正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞漿內(nèi)有CXCL16微弱表達(dá),相對(duì)表達(dá)為0.5±0.837；高脂組大鼠肝組織表達(dá)CXCL16明顯增強(qiáng)。高脂8周、12周、16周組大鼠肝組織CXCL16相對(duì)含量分別為10.67

16、±1.862、21.0±2.898、25.67±4.844,均較正常對(duì)照A組表達(dá)顯著升高(P均<0.01)；大鼠肝組織CXCL16表達(dá)從0周到12周逐漸升高(P均<0.01),但在高脂飲食12周后無(wú)顯著升高。
　　 6.2微生態(tài)制劑對(duì)大鼠肝組織CXCL16表達(dá)的影響
　　 高脂16周組大鼠肝組織CXCL16相對(duì)含量為25.6±4.844,較正常對(duì)照B組(0.67±1.211)顯著升高(P<0.01)；治療組大鼠肝組織陽(yáng)性

17、表達(dá)細(xì)胞數(shù)減少,其CXCL16相對(duì)表達(dá)為8.67±2.805,較治療前顯著下降(P<0.01)。
　　 7相關(guān)分析表明,肝組織CD1d表達(dá)與肝組織NKT細(xì)胞百分含量存在直線相關(guān),r值為0.774,P<0.01；肝組織NKT細(xì)胞百分含量與血清TNF-α水平、IL-12水平、肝組織CXCL16蛋白含量呈負(fù)相關(guān),r值分別為-0.718、-0.767、-0.795,P值均<0.01。
　　 結(jié)論:
　　 1應(yīng)用高脂飲食的