杞薊制劑對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂質(zhì)代謝及炎性反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：近年來(lái)非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)發(fā)病逐漸增多。其廣泛因素參與的病理機(jī)制迄今尚未完全闡明。脂質(zhì)代謝異常被認(rèn)為是最關(guān)鍵和基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)之一，脂質(zhì)代謝異常和其他多種原因誘導(dǎo)枯否氏細(xì)胞(KupfferCell，KC)激活釋放炎癥遞質(zhì)是脂肪肝到NASH的重要階段。本課題將就這兩方面作深入研究。目前對(duì)NASH防治尚無(wú)理想藥物，中醫(yī)藥具有一定的優(yōu)勢(shì)。導(dǎo)師張赤志教授臨床應(yīng)用滋補(bǔ)肝腎、清熱利

2、濕的杞薊制劑(枸杞子、水飛薊賓組成)治療NASH取得良好療效。本課題采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的動(dòng)物模型，用病理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)，探討NASH狀態(tài)下脂質(zhì)代謝紊亂和炎性反應(yīng)情況，闡明NASH發(fā)病機(jī)理及杞薊制劑多靶位防治NASH的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用該制劑防治NASH提供科學(xué)依據(jù)，為新藥開發(fā)打下基礎(chǔ)。 方法：實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行 第一部分:非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型建立及杞薊制劑對(duì)其血清生化和肝組織病理的影響 清潔級(jí)SD

3、大鼠40只隨機(jī)分為4組，每組10只：正常對(duì)照組、空白模型組、杞薊制劑防治組、復(fù)方蛋氨酸膽堿片對(duì)照組。采用高脂飲食(普通飼料加10％豬油、2％膽固醇)復(fù)制大鼠NASH模型。用OlympusAu560全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol,TCH)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminot

4、ransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平，肝組織HE染色，光學(xué)顯微鏡下評(píng)估肝組織脂肪變性和炎癥活動(dòng)程度。 第二部分:杞薊制劑對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控的影響(實(shí)驗(yàn)1-4) 采用高脂飲食復(fù)制大鼠NASH模型。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、空白模型組、杞薊制劑防治組、復(fù)方蛋氨酸膽堿片對(duì)照組。各組大鼠肝組織游離脂肪酸(freefatty acid

5、s,FFA)水平按試劑盒操作在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定，羥胺法檢測(cè)各組大鼠肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、硫代巴比妥酸法檢測(cè)肝組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。原位雜交技術(shù)檢測(cè)各組大鼠肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體 a (peroxisome proliferator activatedreceptor a，PPARa)mRNA的表達(dá)。原位雜交和 Western免疫印

6、跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)各組大鼠肝組織肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver fatty acid binding protein，L-FABP)mRNA和蛋白的表達(dá)。 第三部分:杞薊制劑對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟炎性反應(yīng)的影響(實(shí)驗(yàn)1-2) 采用高脂飲食復(fù)制大鼠NASH模型。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、空白模型組、杞薊制劑防治組、復(fù)方蛋氨酸膽堿片對(duì)照組。免疫組化方法觀察各組大鼠肝組織內(nèi)毒素結(jié)合受體CD<,14>、溶

7、菌酶蛋白的表達(dá)了解KC的變化。免疫組化方法觀察各組大鼠肝組織炎癥介質(zhì)細(xì)胞間粘附因子-1(intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)蛋白的表達(dá)。 結(jié)論： 1.動(dòng)物模型的復(fù)制 本實(shí)驗(yàn)用高脂飲食復(fù)制大鼠NASH動(dòng)物模型，模型組大鼠血脂增高，肝功能損害，肝組織改變符合NASH病理變化，模型復(fù)制率為100％。 2.病理機(jī)制的研究 2.1 NASH大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂：N

8、ASH大鼠肝臟FFA增高，肝臟脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，PPARa mRNA表達(dá)減弱，L-FABP蛋白和mRNA表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂和肝損傷，是NASH的發(fā)病機(jī)制。 2.2 NASH大鼠的肝臟炎性反應(yīng)：NASH大鼠肝臟內(nèi)毒素結(jié)合受體CD14表達(dá)增強(qiáng)，KC激活，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，其綜合作用是NASH發(fā)生發(fā)展的原因之一。 3.杞薊制劑對(duì)NASH的防治作用及機(jī)理 杞薊制劑能降低血清脂質(zhì)、改善肝功能、改善肝組

9、織脂肪變性和炎癥活動(dòng)程度，具有多靶位防治NASH的作用，作用優(yōu)于復(fù)方蛋氨酸膽堿片。具體作用機(jī)理如下。 3.1 杞薊制劑對(duì)NASH大鼠肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)控：杞薊制劑降低肝組織游離脂肪酸水平，從而減少FFA的肝臟毒性和TG積聚；提高肝組織抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)過氧化；增強(qiáng)肝組織PPARa mRNA表達(dá)；減少肝組織L-FABPmRNA和蛋白表達(dá)。杞薊制劑防治NASH的作用機(jī)理與糾正脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。 3.2 杞薊制劑