杞薊制劑對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂質(zhì)代謝及炎性反應的影響.pdf

1、目的：近年來非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)發(fā)病逐漸增多。其廣泛因素參與的病理機制迄今尚未完全闡明。脂質(zhì)代謝異常被認為是最關(guān)鍵和基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)之一，脂質(zhì)代謝異常和其他多種原因誘導枯否氏細胞(KupfferCell，KC)激活釋放炎癥遞質(zhì)是脂肪肝到NASH的重要階段。本課題將就這兩方面作深入研究。目前對NASH防治尚無理想藥物，中醫(yī)藥具有一定的優(yōu)勢。導師張赤志教授臨床應用滋補肝腎、清熱利

2、濕的杞薊制劑(枸杞子、水飛薊賓組成)治療NASH取得良好療效。本課題采用國內(nèi)外公認的動物模型，用病理學、生物化學、分子生物學技術(shù)，探討NASH狀態(tài)下脂質(zhì)代謝紊亂和炎性反應情況，闡明NASH發(fā)病機理及杞薊制劑多靶位防治NASH的作用機制，為臨床應用該制劑防治NASH提供科學依據(jù)，為新藥開發(fā)打下基礎(chǔ)。 方法：實驗分三部分進行 第一部分:非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型建立及杞薊制劑對其血清生化和肝組織病理的影響 清潔級SD

3、大鼠40只隨機分為4組，每組10只：正常對照組、空白模型組、杞薊制劑防治組、復方蛋氨酸膽堿片對照組。采用高脂飲食(普通飼料加10％豬油、2％膽固醇)復制大鼠NASH模型。用OlympusAu560全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol,TCH)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminot

4、ransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平，肝組織HE染色，光學顯微鏡下評估肝組織脂肪變性和炎癥活動程度。 第二部分:杞薊制劑對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控的影響(實驗1-4) 采用高脂飲食復制大鼠NASH模型。大鼠隨機分為正常對照組、空白模型組、杞薊制劑防治組、復方蛋氨酸膽堿片對照組。各組大鼠肝組織游離脂肪酸(freefatty acid

5、s,FFA)水平按試劑盒操作在全自動生化分析儀上測定，羥胺法檢測各組大鼠肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、硫代巴比妥酸法檢測肝組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。原位雜交技術(shù)檢測各組大鼠肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體 a (peroxisome proliferator activatedreceptor a，PPARa)mRNA的表達。原位雜交和 Western免疫印

6、跡(Western blot)技術(shù)檢測各組大鼠肝組織肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver fatty acid binding protein，L-FABP)mRNA和蛋白的表達。 第三部分:杞薊制劑對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟炎性反應的影響(實驗1-2) 采用高脂飲食復制大鼠NASH模型。大鼠隨機分為正常對照組、空白模型組、杞薊制劑防治組、復方蛋氨酸膽堿片對照組。免疫組化方法觀察各組大鼠肝組織內(nèi)毒素結(jié)合受體CD<,14>、溶

7、菌酶蛋白的表達了解KC的變化。免疫組化方法觀察各組大鼠肝組織炎癥介質(zhì)細胞間粘附因子-1(intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)蛋白的表達。 結(jié)論： 1.動物模型的復制 本實驗用高脂飲食復制大鼠NASH動物模型，模型組大鼠血脂增高，肝功能損害，肝組織改變符合NASH病理變化，模型復制率為100％。 2.病理機制的研究 2.1 NASH大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂：N

8、ASH大鼠肝臟FFA增高，肝臟脂質(zhì)過氧化增強，PPARa mRNA表達減弱，L-FABP蛋白和mRNA表達增強，導致脂質(zhì)代謝紊亂和肝損傷，是NASH的發(fā)病機制。 2.2 NASH大鼠的肝臟炎性反應：NASH大鼠肝臟內(nèi)毒素結(jié)合受體CD14表達增強，KC激活，導致炎癥介質(zhì)ICAM-1表達增強，其綜合作用是NASH發(fā)生發(fā)展的原因之一。 3.杞薊制劑對NASH的防治作用及機理 杞薊制劑能降低血清脂質(zhì)、改善肝功能、改善肝組

9、織脂肪變性和炎癥活動程度，具有多靶位防治NASH的作用，作用優(yōu)于復方蛋氨酸膽堿片。具體作用機理如下。 3.1 杞薊制劑對NASH大鼠肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)控：杞薊制劑降低肝組織游離脂肪酸水平，從而減少FFA的肝臟毒性和TG積聚；提高肝組織抗氧化能力，緩解氧化應激，減少脂質(zhì)過氧化；增強肝組織PPARa mRNA表達；減少肝組織L-FABPmRNA和蛋白表達。杞薊制劑防治NASH的作用機理與糾正脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。 3.2 杞薊制劑