槐果堿對(duì)非酒精性脂肪性肝炎防治作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的: 非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一個(gè)臨床病理學(xué)的概念，是指肝組織病理學(xué)上表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性、肝小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、糖原核和Mallory小體，可伴不同程度纖維化，但無(wú)明確飲酒史的一種慢性肝病，是隱源性肝硬化的重要原因，也是代謝綜合征的表現(xiàn)之一。關(guān)于NASH的發(fā)病機(jī)制，目前公認(rèn)的“二次打擊”學(xué)說(shuō)認(rèn)為：初次打擊主要為胰島素抵抗，胰島素抵抗通過促進(jìn)外周脂肪分

2、解和高胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪變性，并啟動(dòng)細(xì)胞適應(yīng)程序，而脂肪變性的肝細(xì)胞活力相對(duì)不足并為氧應(yīng)激提供了足夠的反應(yīng)基質(zhì)，結(jié)果脂肪變性的肝細(xì)胞對(duì)內(nèi)外源性損害因子的敏感性增強(qiáng)；二次打擊主要為反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物增多，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化伴細(xì)胞因子、線粒體解偶聯(lián)蛋白-2和Fas配體被誘導(dǎo)活化，進(jìn)而引起肝組織發(fā)生炎癥、壞死甚至纖維化。NASH的發(fā)生是脂肪變性本身、氧化應(yīng)激及內(nèi)毒素的相互作用的結(jié)果。 NASH的治療目前尚缺乏有效藥物，由于NASH

3、的病因以肥胖、2型糖尿病、高脂血癥最為常見，故針對(duì)這些疾病的治療無(wú)疑是NASH治療的基礎(chǔ)。另外根據(jù)“二次打擊”學(xué)說(shuō)，氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷在NASH的發(fā)病中起著重要作用，提示抗氧化治療是NASH治療的重要對(duì)策，可望阻止NASH進(jìn)展，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道用維生素E、甜菜堿、苦參堿、?；撬岬染哂锌寡趸饔玫乃幬镏委烴ASH患者可顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平，明顯減輕肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化程度。 槐果堿是從中藥苦豆子中提取的一種苦參型生物堿

4、，結(jié)構(gòu)與苦參堿類似。文獻(xiàn)報(bào)道，槐果堿在安全劑量下毒副作用小，其體內(nèi)分布組織內(nèi)濃度較血液高，且價(jià)廉，具有較好的臨床應(yīng)用前景。目前研究證明槐果堿在體外可以滅活內(nèi)毒素，控制內(nèi)毒素通過單核一巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在體內(nèi)激活引起的炎癥反應(yīng)，減輕內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，如全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征等。另有報(bào)道槐果堿在體外具有顯著的抑制肝細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的作用，是一個(gè)高效低毒的抗乙肝病毒的有效藥物。我們以前的研究表明槐果堿可顯著減

5、輕實(shí)驗(yàn)性肝纖維化程度，改善肝功能。關(guān)于其是否具有抗NASH作用尚未見報(bào)道。本研究主要探討槐果堿對(duì)NASH的防治作用及其作用的可能機(jī)理。 研究方法: (一)大鼠實(shí)驗(yàn)性NASH模型的制備 8只160g左右SD雄性大鼠，隨機(jī)分為2組，每組4只。Ⅰ組為正常組，喂飼普通飼料12周；Ⅱ組為模型組，喂飼高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+100g/kg豬油+20g/kg膽固醇)12周。12周末給大鼠禁食12小時(shí)，稱量體重后予20％烏拉坦腹腔注

6、射麻醉，剖開腹腔，切取全部肝臟，觀察肝臟大體外觀。從肝右葉切取組織用生理鹽水沖洗后浸泡在10％中性緩沖福爾馬林溶液中。將福爾馬林浸泡的組織，用石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度和肝組織炎癥反應(yīng)程度。對(duì)比兩組大鼠大體標(biāo)本和病理結(jié)果，評(píng)估NASH模型制備情況。 (二)槐果堿對(duì)大鼠NASH的防治作用 32只180g左右SD雄性大鼠，隨機(jī)分為4組，每組8只。Ⅰ組為正常組，喂飼普通飼料12周；Ⅱ組為模型組，喂飼高

7、脂飼料(基礎(chǔ)飼料+100g/kg豬油+20g/kg膽固醇)12周；Ⅲ組為槐果堿預(yù)防組，喂飼高脂飼料同時(shí)予槐果堿背部皮下注射(20mg/kg體重/d)12周；Ⅳ組為槐果堿治療組，喂飼高脂飼料12周，第5周開始予槐果堿背部皮下注射。 實(shí)驗(yàn)第12周末給大鼠禁食12小時(shí)，稱量體重后予20％烏拉坦腹腔注射麻醉，剖開腹腔，經(jīng)下腔靜脈抽血，化驗(yàn)血清血脂(Tch、TG、HDL、LDL)和肝功(ALT、AST)。切取全部肝臟，稱肝重，計(jì)算肝指數(shù)。

8、從肝右葉切取部分組織用生理鹽水沖洗后浸泡在10％中性緩沖福爾馬林溶液中，再取部分組織-70℃液氮凍存。將福爾馬林浸泡的組織，用石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE染色、V-G染色觀察肝組織炎癥反應(yīng)程度和纖維沉積情況，并進(jìn)行炎癥活動(dòng)度(G)的分級(jí)和纖維化程度(S)的分期。部分肝組織冰凍切片行蘇丹Ⅲ染色，觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度。用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α1(TGF-β1)蛋白表

9、達(dá)情況。將部分凍存組織勻漿，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)、IL-6、TNF-α、TGF-β1、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)和Ⅰ型前膠原(Procollagen-Ⅰ)的mRNA的表達(dá)。 (三)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較用方差分析；病理和免疫組化分級(jí)采用秩和檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS11.0軟件包處理，P＜0.05為差異有顯著性。

10、 研究結(jié)果: (一)大鼠實(shí)驗(yàn)性NASH模型的制備 大鼠喂飼高脂飼料12周后可見其肝臟體積較正常鼠明顯增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，表面呈奶黃色；肝臟HE染色顯示肝細(xì)胞重度脂肪變性，并可見Mallory小體，肝小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞點(diǎn)狀或融合性壞死灶。正常組大鼠肝臟未見上述改變。表明用高脂飼料能成功復(fù)制出NASH模型。 (二)槐果堿對(duì)大鼠NASH的防治作用 1.槐果堿對(duì)肝重、肝指數(shù)的影響：正常組肝重為14.

11、885±1.591g，肝指數(shù)為0.0319±0.0019；模型組肝重為18.905±2.110g，肝指數(shù)為0.0381±0.0038；槐果堿預(yù)防組肝重為14.440±1.997g，肝指數(shù)為0.0312±0.0020；槐果堿治療組肝重為15.766±1.777g，肝指數(shù)為0.0328±0.0026。模型組肝重、肝指數(shù)較正常組明顯升高(P＜0.05)，槐果堿干預(yù)組肝重、肝指數(shù)較模型組明顯下降(P＜0.05)，但預(yù)防組與治療組間無(wú)顯著性差異(

12、P＞0.05)。 2.槐果堿對(duì)肝功能的影響：正常組血清ALT為35.38±5.19 U/L；模型組為73.00±19.54U/L；槐果堿預(yù)防組為52.13±10.53U/L；槐果堿治療組為54.86±8.42 U/L。模型組血清ALT較正常組明顯升高(P＜0.05)，槐果堿干預(yù)組血清ALT較模型組明顯下降(P＜0.05)，但預(yù)防組與治療組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。血清AST在槐果堿干預(yù)組與模型組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05

13、)。 3.槐果堿對(duì)血脂的影響：正常組血清Tch、TG、HDL、LDL分別為0.56±0.239mmol/L，0.26±0.071 mmol/L，1.10±0.150 mmol/L，0.25±0.063 mmol/L；模型組分別為4.28±0.572mmol/L，0.40±0.149mmol/L，2.04±0.193mmol/L，2.85±0.512 mmol/L；槐果堿預(yù)防組分別為3.07±0.846mmol/L，0.27±0.

14、082 mmol/L，1.55±0.254mmol/L，2.31±0.669 mmol/L；槐果堿治療組分別為3.95±0.906 mmol/L，0.33±0.067 mmol/L，1.78±0.266 mmol/L，2.81±0.832 mmol/L。模型組血清Tch、TG、HDL、LDL較正常組明顯升高(P＜0.05)；槐果堿預(yù)防組血清Tch、TG、HDL較模型組明顯下降(P＜0.05)，LDL較模型組無(wú)明顯下降(P＞0.05)；槐

15、果堿治療組血清HDL較模型組明顯下降(P＜0.05)，Tch、TG、LDL較模型組無(wú)明顯下降(P＞0.05)。 4.槐果堿對(duì)組織病理的影響：HE染色顯示槐果堿干預(yù)組肝組織炎癥反應(yīng)程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)；蘇丹Ⅲ染色顯示槐果堿干預(yù)組肝細(xì)胞脂肪變性程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)；V-G染色顯示槐果堿干預(yù)組肝組織纖維化程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)。預(yù)防組較治療組脂肪變性、炎癥反應(yīng)、纖維化程度輕，但兩組間差異無(wú)

16、顯著性(P＞0.05)。 5.槐果堿對(duì)肝組織中細(xì)胞因子表達(dá)的影響：免疫組化顯示槐果堿干預(yù)組肝組織中IL-6、TNF-α、TGF-β1蛋白表達(dá)較模型組明顯降低(P＜0.05)。RT-PCR檢測(cè)顯示槐果堿干預(yù)組肝組織中IL-6、TNF-α、FGF-β1 mRNA表達(dá)較模型組明顯降低(P＜0.05)，Leptin、α-SMA、Procollagen-Ⅰ mRNA表達(dá)也較模型組明顯降低(P＜0.05)，而Adiponectin mRNA