微生態(tài)制劑防治非酒精性脂肪性肝炎作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是無過量飲酒史而病理學(xué)與酒精性肝炎相似,以肝細(xì)胞脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥伴灶性壞死為特征的一類遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性臨床病理綜合征,常合并肥胖、糖尿病和高脂血癥,其發(fā)病率逐年增高。研究證明約30％NASH患者可進(jìn)展為肝纖維化,甚至肝硬化,而成為隱源性肝硬化的重要因?yàn)橹弧Ｄ壳?NASH的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,Dye和James[1]提出的“

2、二次打擊”學(xué)說認(rèn)為,胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、內(nèi)毒素血癥及炎癥細(xì)胞因子等共同參與了NASH的病理生理環(huán)節(jié)。目前臨床上藥物治療效果尚不理想。本研究采用高脂飲食建立NASH大鼠模型,通過檢測(cè)血脂、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、內(nèi)毒素及脂聯(lián)素的表達(dá)水平,以探討NASH的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)應(yīng)用微生態(tài)制劑(金雙歧)進(jìn)行干預(yù)性治療,觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠內(nèi)毒素血癥、脂聯(lián)素

3、及肝臟脂聯(lián)素受體-2(adiponectin receptor-2,AdipoR-2)的影響,為今后NASH的有效防治提供新的思路。
　　 方法:健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠30只,體重140±10g,由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分籠飼養(yǎng),每籠4-6只,按晝夜時(shí)程,在室溫及穩(wěn)定濕度條件下,用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為五組:
　　 a正常對(duì)照組6只:標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)16周。
　　 b高脂模型組6只:高脂飼料(8

4、3％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油+5％玉米油)喂養(yǎng)16周。
　　 c高脂+金雙歧組6只:高脂飼料喂養(yǎng)12周后,給予金雙歧(400mg/kg·d)灌胃,每日1次,共4周,其他組以相同劑量蒸餾水灌胃。
　　 d正常+內(nèi)毒素組6只:標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)16周后,給予LPS(1mg/kg)腹腔注射,a,b,c組以相同劑量蒸餾水腹腔注射。
　　 e高脂+內(nèi)毒素組6只:高脂飼料喂養(yǎng)16周后,給予LPS(1mg/kg)腹腔注射,a

5、,b,c組以相同劑量蒸餾水腹腔注射。
　　 于16周末股動(dòng)脈放血處死正常對(duì)照組大鼠6只和高脂模型組大鼠6只,觀察肝臟的大體形態(tài),稱肝濕重,留取血清及肝組織標(biāo)本,以備血清學(xué)、肝組織病理及分子生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。經(jīng)肝組織病理檢查證實(shí)16周時(shí)NASH大鼠模型已形成。高脂+金雙歧組大鼠于12周開始給予金雙歧(400mg/kg·d)灌胃,每日1次,共4周,其他組以相同劑量蒸餾水灌胃,16周末處死。正常+內(nèi)毒素組大鼠于標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)16周后給予L

6、PS(1mg/kg)腹腔注射,6小時(shí)后股動(dòng)脈放血處死留取標(biāo)本。高脂+內(nèi)毒素組大鼠于16周NASH模型形成后給予LPS(1mg/kg)腹腔注射,其他組以相同劑量蒸餾水注射,6小時(shí)后股動(dòng)脈放血處死留取標(biāo)本。取肝右葉組織3塊,分別用于快速冰凍切片,行SudanⅣ染色,觀察肝細(xì)胞脂變情況；10％的甲醛固定用于HE染色及Masson染色,觀察肝組織的炎癥、細(xì)胞病變及纖維化程度；余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。
　　 測(cè)量體質(zhì)量、

7、肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％),用日本OlympusAU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清膽固醇(cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平；用顯色基質(zhì)鱟試劑定量檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平；用ELISA雙抗體夾心法測(cè)定血清腫瘤壞死因子α(tumor

8、necrosis actor alpha,TNF-α)的表達(dá)水平。HE染色觀察肝組織普通病理變化；Masson三重染色觀察肝纖維化程度；SudanⅣ染色觀察肝細(xì)胞脂變的程度；用western blot方法檢測(cè)肝組織.AdipoR-2蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.實(shí)驗(yàn)大鼠的一般表現(xiàn):正常對(duì)照組大鼠,食欲佳,皮毛光滑,精神狀態(tài)好,體質(zhì)量進(jìn)行性增加；NASH模型組大鼠精神萎靡,活動(dòng)減少,食欲減退,皮毛欠光澤,均呈明

9、顯腹型肥胖,體質(zhì)量、肝指數(shù)與正常對(duì)照組相比顯著增高(P<0.01)；金雙歧組大鼠精神、食欲及活動(dòng)介于正常對(duì)照組與模型組之間,體質(zhì)量、肝指數(shù)較模型組顯著下降(P<0.01)；內(nèi)毒素組大鼠注射LPS后精神極度萎靡,反應(yīng)遲緩,口唇青紫,毛色干枯,正常+內(nèi)毒素組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)較正常對(duì)照組未見明顯差異(P>0.05)；高脂+內(nèi)毒素組體質(zhì)量、肝指數(shù)與正常+內(nèi)毒素組相比顯著增高(P<0.01),但與模型組相比無明顯差異(P>0.05)。
　

10、　 2.生化指標(biāo):NASH模型組大鼠血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)均顯著高于正常對(duì)照組(P值均<0.01)；金雙歧組上述各指標(biāo)均較模型組明顯下降(P值分別為<0.01、<0.05、<0.05、<0.01)；正常+內(nèi)毒素組與正常對(duì)照組比較,上述指標(biāo)無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；高脂+內(nèi)毒素組與模型組相比,血清TC、TG表達(dá)水平無明顯差異(P值均>0.05

11、),ALT、AST水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01),但上述各指標(biāo)均顯著高于正常+內(nèi)毒素組(P值均<0.01)。
　　 3.血清脂聯(lián)素、血漿內(nèi)毒素、血清TNF-α水平:與正常對(duì)照組相比較,NASH模型組大鼠血清脂聯(lián)素水平明顯下降(P<0.01),血漿內(nèi)毒素(P<0.05)及血清TNF-α(P<0.01)水平明顯增高；金雙歧組與模型組相比血清脂聯(lián)素升高,內(nèi)毒素及TNF-α水平較前下降(P值分別為<0.01、<0.0

12、5、<0.01)；正常+內(nèi)毒素組大鼠注射LPS后血漿內(nèi)毒素水平較正常對(duì)照組增高(P<0.01),而TNF-α及脂聯(lián)素水平維持原水平；與之相反,高脂+內(nèi)毒素組大鼠血漿內(nèi)毒素及血清TNF-α水平較模型組明顯升高(P<0.01),脂聯(lián)素水平無顯著性差異(P>0.05),與正常+內(nèi)毒素組相比,血清脂聯(lián)素水平下降(P<0.01),血漿內(nèi)毒素及血清TNF-α水平均明顯增高(P值分別為<0.05、<0.01)。
　　 4.肝組織病理學(xué)檢查:肉

13、眼觀察,正常對(duì)照組大鼠肝臟外觀為紅褐色,明亮有光澤；模型組大鼠肝臟體積明顯增大,顏色為淺黃至土黃色,與周圍組織有粘連,切面油膩感,無光澤；金雙歧組大鼠肝臟外觀介于正常組和模型組之間；正常+內(nèi)毒素組大鼠肝臟外觀與正常對(duì)照組無明顯差異；高脂+內(nèi)毒素組大鼠肝臟外觀與高脂組無明顯差異。光鏡下,HE染色示正常大鼠肝細(xì)胞索以肝小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列,匯管區(qū)無明顯炎細(xì)胞浸潤,Masson三重染色示中央靜脈及匯管區(qū)未見明顯膠原纖維,SudanⅣ

14、染色肝細(xì)胞胞漿中無紅染脂滴；模型組大鼠肝組織HE染色示肝細(xì)胞濁腫,胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡,可見小葉內(nèi)點(diǎn)狀或灶性壞死,以肝腺泡Ⅲ區(qū)最為明顯,匯管區(qū)擴(kuò)大并可見中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,Masson三重染色示匯管區(qū)可見膠原纖維沉積,部分出現(xiàn)竇周及中央靜脈周圍纖維化,SudanⅣ染色可見肝細(xì)胞內(nèi)充滿橙紅色脂滴,肝組織呈彌漫性脂肪變；金雙歧組大鼠肝細(xì)胞病變、炎癥活動(dòng)度及脂肪變性、纖維化程度均較模型組顯著降低；正常+內(nèi)毒素組較正常對(duì)照組肝組織病理未

15、見明顯異常；而高脂+內(nèi)毒素組HE染色可見肝小葉炎癥較模型組加重,可見碎屑樣壞死和橋接壞死,肝竇內(nèi)有血細(xì)胞淤積,Masson三重染色及SudanⅣ染色示肝纖維化及脂變程度無明顯差異。
　　 5.AdipoR-2蛋白在肝組織中的表達(dá):與正常對(duì)照組相比較,模型組大鼠肝組織AdipoR-2蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；金雙歧可上調(diào)其表達(dá)(P<0.05)；正常+內(nèi)毒素組較正常對(duì)照組肝組織AdipoR-2蛋白的表達(dá)水平無明顯差異(P>

16、0.05)；高脂+內(nèi)毒素組與模型組相比無顯著性差異(P>0.05),與正常+內(nèi)毒素組相比其表達(dá)明顯降低(P<0.01)。
　　 6.相關(guān)性分析:NASH模型組大鼠血清TNF-α水平與ALT、AST表達(dá)水平呈正相關(guān)(r值分別為0.940、0.970,P值分別為<0.01、<0.01)；血清脂聯(lián)素的表達(dá)水平與血清TG水平呈負(fù)相關(guān)(r值為-0.890,P<0.05),與肝組織AdipoR-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r值為0.978,P<0

17、.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.長期高脂高膽固醇飲食可成功建立NASH大鼠模型,脂質(zhì)代謝紊亂是NASH發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制。
　　 2.TNF-α及內(nèi)毒素血癥在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,并且NASH模型組大鼠對(duì)內(nèi)毒素的敏感性明顯增加。
　　 3.血清脂聯(lián)素水平下降及肝組織AdipoR-2的表達(dá)減弱在NASH大鼠肝組織損傷方面發(fā)揮重要作用。
　　 4.微生態(tài)制劑可通過補(bǔ)充腸道正常