CD36缺失促進非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生的分子機制研究.pdf

1、目的：隨著肥胖人群的增多，非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率日益增加。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）以肝臟脂肪變性同時伴有炎癥為主要病理特征，它的發(fā)生可以促使NAFLD轉(zhuǎn)向肝硬化、肝癌等惡性結(jié)局。然而NASH的具體機制目前尚不十分明確，因此缺乏有效的治療手段。人白細胞分化抗原36（Cluster of Di

2、fferentiation36，CD36），又稱為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（Fatty acid translocase，F(xiàn)AT），作為重要的脂肪酸轉(zhuǎn)運體介導脂肪酸的轉(zhuǎn)運；同時它屬于清道夫受體B類Ⅱ型，可以激活細胞內(nèi)多種炎癥信號通路，參與炎癥的發(fā)生。大量研究證實CD36在肝臟的異常高表達與NAFLD的病變程度呈正相關(guān)，但在CD36缺乏人群和CD36基因敲除小鼠模型中，CD36缺失同樣能促進NAFLD發(fā)生。本研究旨在探討CD36缺失促進NASH發(fā)生的

3、分子機制，為CD36缺失人群NASH的防治工作提供重要的理論依據(jù)。
　　方法：第一部分：以C57BL/6J為背景的野生型（widetype，WT）小鼠和CD36基因敲除（CD36-/-）小鼠為動物模型，分別給予正常飲食（NCD）和高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)。對HepG2細胞和THP-1細胞進行CD36 RNAi處理，或者從WT小鼠和CD36-/-小鼠肝臟分離出的原代
　　肝細胞和Kupffer細胞，給予棕櫚酸PA處理。HE染色了

4、解肝組織炎癥程度；油紅O染色和甘油三酯（TG）含量檢測肝臟組織脂質(zhì)蓄積情況；天狼猩紅染色了解肝臟纖維化程度；實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測炎癥因子（腫瘤壞死因子-α，TNF-α；白介素1-β，IL-1β；白介素-6，IL-6）、膠原Ⅰ（CollageⅠ）、膠原Ⅳ（CollageⅣ）的基因表達。
　　第二部分：利用第一部分中的動物模型和細胞模型，給予WT小鼠和CD36-/-小鼠腹腔注射氯化釓，同時高脂飲食喂養(yǎng)；利用Trans

5、well小室共培養(yǎng)HepG2細胞和THP-1細胞，分別進行CD36 RNAi后給予PA處理。免疫組化染色了解F4/80陽性細胞在肝臟的分布；HE染色了解肝組織炎癥程度；天狼猩紅染色了解肝臟纖維化程度；油紅O染色檢測肝臟組織脂質(zhì)蓄積情況；結(jié)晶紫染色了解巨噬細胞遷移情況；RT-PCR檢測炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、趨化因子（單核細胞趨化蛋白-1，MCP-1；巨噬細胞炎性蛋白-1，MIP-1；巨噬細胞炎性蛋白-2，MIP-2

6、）的基因表達。
　　第三部分：利用前面的動物模型和細胞，給予細胞去乙?；锩窰DAC抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）、HDAC2 RNAi、過氧化氫（H2O2）處理。RT-PCR檢測去乙酰化物酶（HDAC1-11）、MCP-1的基因表達情況；利用免疫組化染色了解HDAC2在肝組織和細胞內(nèi)的分布情況；利用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)的方法檢測MCP-1啟動子區(qū)域的組蛋白3（H3）乙?；降淖兓?br>　　

7、結(jié)果：第一部分： CD36-/-小鼠肝臟氣球樣變性和炎性細胞浸潤，纖維化程度，脂質(zhì)蓄積程度明顯多于WT小鼠，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和膠原CollageⅠ、CollageⅣ的基因表達明顯高于WT小鼠（P<0.05），TG含量明顯高于WT小鼠（P<0.05），提示CD36缺失能促進小鼠肝臟NASH的發(fā)生。而在體外培養(yǎng)的小鼠原代肝細胞、Kupffer細胞、HepG2細胞和THP-1細胞中，炎癥因子的表達在CD36 RNAi或

8、者CD36-/-組均明顯低于NC或者WT組（P<0.05），提示CD36缺失能明顯減輕體外單獨培養(yǎng)的肝細胞或者巨噬細胞中炎癥因子的表達。
　　第二部分：F4/80免疫組化染色提示CD36-/-小鼠肝臟巨噬細胞浸潤較WT小鼠明顯增加。氯化釓注射后， CD36-/-小鼠肝臟炎癥因子表達低于WT小鼠（P<0.05），纖維化程度低于WT小鼠，提示抑制巨噬細胞浸潤能有效改善CD36缺失誘發(fā)的肝臟炎癥和纖維化。體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中，HepG2細胞

9、內(nèi)CD36下調(diào)促進THP-1細胞遷移，而THP-1細胞內(nèi)CD36下調(diào)抑制巨噬細胞細胞遷移；共培養(yǎng)中THP-1細胞數(shù)量增加能明顯增加HepG2細胞中炎癥因子表達（P<0.05）。上述結(jié)果提示肝細胞中CD36缺失能誘發(fā)巨噬細胞浸潤，而巨噬細胞浸潤增加能反作用于肝細胞而促進炎癥的發(fā)生。進一步檢測趨化因子發(fā)現(xiàn)，MCP-1在氯化釓注射后的CD36-/-小鼠肝臟以及CD36 RNAi HepG2細胞中表達明顯增加（P<0.05），在CD36 RNA

10、i THP-1細胞中下降（P<0.05），而其他趨化因子MIP-1、MIP-2表達在氯化釓注射后的CD36-/-小鼠肝臟， CD36 RNAi HepG2細胞以及 CD36 RNAi THP-1細胞中表達下降（P<0.05）。上述結(jié)果提示CD36缺失促進肝細胞中MCP-1表達增加，是誘發(fā)巨噬細胞浸潤的主要原因。
　　第三部分：ChIP實驗提示，HepG2細胞中CD36 RNAi可以增加MCP-1啟動子區(qū)域的H3乙?；鳷HP-1

11、細胞中CD36 RNAi降低MCP-1啟動子區(qū)域的H3乙?；?。免疫組化染色提示，HDAC2在WT小鼠肝細胞和HepG2細胞核內(nèi)表達豐富，CD36缺失能明顯抑制肝細胞核內(nèi)HDAC2的表達但在CD36-/-小鼠肝細胞和CD36 RNAi HepG2細胞核內(nèi)表達明顯減少；但HDAC2在小鼠非實質(zhì)細胞、Kupffer細胞、THP-1細胞核內(nèi)表達極少，CD36缺失不影響巨噬細胞中HDAC2表達。TSA處理或HDAC2 RNAi能明顯上調(diào)HepG2

12、細胞中MCP-1基因表達（P<0.05），但對THP-1細胞中MCP-1基因表達沒有影響，提示HDAC2可以調(diào)控肝細胞內(nèi)MCP-1表達而不能調(diào)控巨噬細胞中的MCP-1表達。綜上所述，肝細胞中CD36缺失能通過抑制核內(nèi)HDAC2表達上調(diào)MCP-1啟動子區(qū)域組蛋白的乙?；?，從而增加MCP-1基因的表達；而巨噬細胞內(nèi)由于HDAC2表達不如肝細胞豐富，CD36缺失不能通過HDAC2途徑調(diào)控MCP-1基因的表達。
　　HDAC活性與RO

13、S密切相關(guān)，CD36缺失可以減少肝組織和肝細胞內(nèi)H2O2和ROS水平（P<0.05）。小劑量補充H2O2可以恢復CD36 RNAi HepG2細胞中HDAC2表達、降低MCP-1啟動子區(qū)域H3乙?；?、減少MCP-1基因表達的增加（P<0.05），提示肝細胞內(nèi)CD36缺失通過減少ROS產(chǎn)量來抑制核內(nèi)HDAC2表達，從而促進MCP-1基因表達。
　　結(jié)論：
　　1．CD36缺失能明顯促進小鼠肝臟NASH的發(fā)生。
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