川續(xù)斷皂苷VI治療非酒精性脂肪性肝炎及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討川續(xù)斷皂苷 VI對(duì)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的防治作用及其作用機(jī)制。
　　方法:應(yīng)用ob/ob雄性小鼠建立非酒精性脂肪性肝炎模型,36只ob/ob小鼠,隨機(jī)分成模型組和川續(xù)斷皂苷 VI低、中、高劑量組,正常組小鼠用 C57BL/6J雄性小鼠代替(每組9只)。正常組喂食基礎(chǔ)飼料,模型組和各治療組喂食高脂飼料,喂食高脂飼料的同時(shí)開始給藥,川續(xù)斷皂苷VI各劑量治療組分別按30、60、120mg/kg·d腹腔注射給藥,正常組

2、和模型組分別腹腔注射等量生理鹽水,連續(xù)給藥4周后取材;稱量各組小鼠體重,肝組織濕重,計(jì)算各組肝指數(shù);制備肝線粒體和組織勻漿,檢測(cè)肝線粒體膜電位變化和線粒體ROS含量;進(jìn)行血脂和肝功能檢測(cè);采用HE染色法觀察肝組織病理學(xué)改變,電鏡法觀察肝組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)肝組織丙二醛(MDA)含量;比色法檢測(cè)肝組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性;Western blot檢測(cè) P-

3、JNK、Bax、Bcl-2、Cytochrome C蛋白表達(dá)情況。采用棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)大鼠BRL細(xì)胞建立非酒精性脂肪性肝炎體外模型,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置對(duì)照組、PA處理組、川續(xù)斷皂苷VI低、中、高濃度預(yù)保護(hù)組。采用MTT法檢測(cè)PA對(duì)BRL細(xì)胞活性的影響;Bodipy493/503染色法檢測(cè)BRL細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化;Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Western blot檢測(cè)P-JNK

4、、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)與正常組相比,模型組小鼠體重和肝指數(shù)明顯增加(P<0.05),與模型組相比,川續(xù)斷皂苷VI各劑量組體重、肝指數(shù)均有所降低,其中高劑量組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);(2)與正常組相比,模型組小鼠肝功能(ALT、AST)受損嚴(yán)重,組織病理學(xué)顯示肝小葉結(jié)構(gòu)排列紊亂,肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的脂肪變性,細(xì)胞體積明顯變大,細(xì)胞核被擠在邊緣,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量脂肪

5、空泡,形態(tài)與脂肪細(xì)胞類似,伴有不同程度的細(xì)胞碎屑樣壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn),部分肝組織出現(xiàn)輕、中度炎癥及凋亡小體形成等病理改變,出現(xiàn)NASH病理特征,血脂(TC、TG、LDL-C)及肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)(MDA)均明顯升高(P均<0.05),血脂HDL-C以及肝組織GSH-PX、SOD的活性均明顯降低(P均<0.05);川續(xù)斷皂苷VI高劑量組與模型組相比,血清ALT、AST水平和肝組織脂肪變性、炎癥程度均顯著下降,血清TC、TG、LDL-C和肝組

6、織MDA含量明顯降低(P均<0.05)HDL-C及GSH-PX、SOD的活性增加(P均<0.05);(3)模型組小鼠肝線粒體膜電位降低、ROS含量升高,與正常組相比有顯著性差異(P<0.05);川續(xù)斷皂苷 VI處理組線粒體膜電位升高、ROS含量降低,和模型組相比有顯著性差異(P<0.05),并呈現(xiàn)劑量依賴性;(4)與正常組小鼠相比,模型P-JNK、Bax和Cytochrome C蛋白表達(dá)增強(qiáng),Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05);

7、川續(xù)斷皂苷VI各劑量組P-JNK、Cytochrome C和Bax蛋白表達(dá)較模型組相比降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平增強(qiáng),其中川續(xù)斷皂苷VI高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)不同濃度(50、100、150、200μmol/L)的PA作用于BRL細(xì)胞24h和48h后,細(xì)胞存活率較對(duì)照組均有下降,當(dāng)細(xì)胞濃度為大于150μmol/L作用細(xì)胞48 h存活率低于50％,因此,為了降低PA對(duì)肝細(xì)胞的毒性,在后

8、續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們選用48h IC50濃度(150μmol/L)作為PA最佳誘導(dǎo)濃度(2)PA誘導(dǎo)的BRL細(xì)胞48h,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯,川續(xù)斷皂苷VI高濃度組可有效抑制脂質(zhì)沉積(P<0.05)。(3)PA誘導(dǎo)的BRL細(xì)胞48h,與對(duì)照組相比,細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)、凋亡細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化;與PA組相比,川續(xù)斷皂苷VI各濃度組可有效抑制肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。(4)PA誘導(dǎo)的BRL細(xì)胞P-JNK、Bax蛋白表達(dá)量明顯增加,Bcl-2蛋白表

9、達(dá)量顯著減少(P<0.05);與PA組相比,川續(xù)斷皂苷VI各濃度組可不同程度抑制P-JNK、Bax蛋白的表達(dá),促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá),有效抑制肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生,中、高濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功制備與人體NASH病理特點(diǎn)比擬的實(shí)驗(yàn)性小鼠模型,以及NASH體外模型,為NASH發(fā)病機(jī)制及藥物等干預(yù)性研究提供了較好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　2.川續(xù)斷皂苷VI可能通過(guò)抑制ob/ob小鼠體內(nèi)氧