干擾素-α對PDGF-BB刺激肝星狀細(xì)胞分泌ECM及TGF-β-,1-表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：肝纖維化是多種病因?qū)е侣愿尾」灿械牟±砀淖儯卫w維化的顯著特征是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的增加和成分的改變。目前研究表明，肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化和增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵和中心環(huán)節(jié)。HSC具有生成ECM，分泌細(xì)胞因子以及收縮等多種功能，在肝硬化、門靜脈高壓癥的發(fā)生發(fā)展中起了關(guān)鍵性的作用[4-6]。近年來的研究表明，細(xì)胞因子在肝纖維化形成中發(fā)揮重要的作用，以轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transf

2、orming growth factor-β1，TGF-β1)的促纖維化生成作用最強(qiáng)；血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)作為HSC的強(qiáng)有力的促有絲分裂原，可促進(jìn)HSC分裂、增殖和活化靜息狀態(tài)的HSC激活為成纖維母細(xì)胞合成大量ECM，在肝纖維化形成和發(fā)展過程中起著重要的作用。ECM包括膠原、非膠原糖蛋白以及蛋白聚糖，主要以膠原為主。正常情況下HSC分泌的膠原以Ⅲ、Ⅳ型膠原為主，僅合

3、成少量的Ⅰ型膠原。在肝臟損傷時，HSC被激活，合成大量的以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的ECM。Ⅰ型膠原可促進(jìn)HSC激活、增殖，并抑制肝細(xì)胞及竇內(nèi)皮細(xì)胞的增生，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。目前干擾素-α(IFN-α)作為抗病毒的藥物已應(yīng)用于肝炎的臨床治療中。但對于IFN-α的抗肝纖維化的機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過觀察IFN-α對于PDGF-BB刺激體外培養(yǎng)的HSC分泌Ⅰ型膠原(Col-I)及TGF-β1表達(dá)的影響，以期闡述IFN-α抗肝纖維化的部分作用機(jī)

4、制，為臨床肝纖維化的藥物治療提供更多的理論依據(jù)。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、大鼠肝星狀細(xì)胞株(r-HSC99)中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院感染科研究室提供。 2、主要試劑 重組人干擾素-α 2b(IFN-α 2b)(Prospec公司)；血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)(Peprotech Asia公司)；MTT(武漢博士德生物公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司產(chǎn)

5、品)；瓊脂糖(Sigma公司)；酶標(biāo)儀(Labsystems Dragon公司)；Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogin公司)；RT-PCR試劑盒、β-actin引物、Ⅰ型膠原(Col-I)引物、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)引物(大連寶生物工程有限公司)；DNAmarker(MBI公司)。 二、實(shí)驗(yàn)方法 體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞系rHSC-99，分別用不同濃度的IFN-α、PDGF-BB干預(yù)和兩者共同干預(yù)

6、，用四甲基偶氮唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)(MTT)觀察各組對HSC增殖的影響，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測定各組對HSC細(xì)胞Col-ImRNA和TGF-β1mRNA表達(dá)的影響。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSSV13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間是否存在顯著性差異分析采用One-way ANOVA分析，LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、MTT檢測結(jié)果分別

7、用不同濃度的IFN-α(0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125ng/ml)，20ng/mlPDGF-BB及不同濃度的IFN-α(0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125ng/ml)+20ng/mlPDGF-BB作用于HSC，并設(shè)對照組，應(yīng)用MTT法檢測吸光度值(A值)，經(jīng)方差分析，20ng/mlPDGF-BB組及(0.4、0.2、0.1、0.05ng/ml)IFN-α+PDGF-BB五組與對照組的A

8、值比較均有顯著性差異，均P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他干預(yù)組無顯著性差異。PDGF-BB組較對照組A值高，(0.4、0.2、0.1、0.05ng/ml)IFN-α+PDGF-BB四組A值均較對照組A值低，說明PDGF-BB可促進(jìn)HSC的增殖，單獨(dú)IFN-α干預(yù)對HSC的增殖無明顯的抑制作用，但I(xiàn)FN-α與PDGF-BB共同作用可明顯抑制HSC的增殖，且在0.025ng/ml-0.1ng/ml范圍內(nèi)能呈劑量依賴性抑制HSC的增殖。

9、 2、RT-PCR檢測結(jié)果不同干預(yù)組作用于HSC，分別作用12h、24h、48h、72h后，對Col-I及TGF-β1基因表達(dá)的影響：用RT-PCR檢測Col-I及TGF-β1基因相對表達(dá)值，各時間點(diǎn)PDGF-BB(20ng/ml)組Col-I，TGF-β1基因表達(dá)水平均較正常對照組明顯增高，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四個時間點(diǎn)，(0.2、0.1、0.05 ng/ml)IFN-α+PDGF-BB三組Col-I，TG

10、F-β1基因表達(dá)水平均較對照組有降低，經(jīng)方差分析，四個時間點(diǎn)的上述三個干預(yù)組與相應(yīng)的對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且隨著IFN-α濃度的增加及時間的延長差異越顯著；其他干預(yù)組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PDGF-BB增強(qiáng)HSC的Col-ImRNA和TGFβ1mRNA表達(dá)，IFN-α單獨(dú)干預(yù)對HSC的Col-ImRNA和TGF-β1mRNA表達(dá)無明顯影響，但I(xiàn)FN-α,與PDGF-BB共同作用可明顯抑制HSC