Megsin基因?qū)Ω咛黔h(huán)境下小鼠腎臟系膜細胞PDGF-BB、pERK1-2、TGF-β1的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見、最嚴重的并發(fā)癥之一。近年來,隨著生活水平的提高,生活方式的改變,DN的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,其逐漸成為導致終末期腎衰竭(end-stage renalfailure,ESRF)的首位或主要病因,給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。
　　 DN的主要病理學表現(xiàn)為腎臟體積增大,腎小球基底膜增厚,系膜細胞增生、肥大及系膜區(qū)細胞外基質(zhì)(extracellula

2、r matrix,ECM)進行性積聚,并逐步發(fā)展為腎小球硬化。系膜細胞是腎小球固有細胞的一種,在維持腎小球的正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用,同時不可避免的參與了DN的發(fā)病過程。Megsin是一種系膜細胞優(yōu)勢表達基因,定位于染色體18q21.3,同源性分析顯示該基因?qū)儆趕eprin超家族一員。Serpin功能廣泛、成員眾多,主要參與血液凝固、纖維蛋白溶解、補體激活、炎癥反應(yīng)、及組織重建等過程,對細胞增生、凋亡、信號轉(zhuǎn)導、細胞外基質(zhì)代謝等

3、發(fā)揮重要影響。Megsin作為serpin的成員之一,勢必參與系膜細胞的某些生理、病理活動,因此探討megsin在腎小球系膜細胞中的作用對于深入揭示DN的發(fā)生機制具有重要意義。
　　 DN的發(fā)生、發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果,如生化代謝紊亂、腎小球血流動力學異常、細胞因子異常分泌、氧化應(yīng)激等,其中PDGF、TGF-β是兩類對系膜細胞增殖和ECM積聚具有重要影響的細胞因子。研究表明,高糖環(huán)境下,腎小球系膜細胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1(t

4、ransforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)、血小板源性生長因子-BB(platelet derived growthfactor-BB,PDGF-BB)的mRNA表達均增高,ERK(extracellularsignal-regulated protein kinase)信號轉(zhuǎn)導通路被激活。PDGF-BB可能通過ERK通路作用于系膜細胞,上調(diào)TGF-β1mRNA的表達,促進ECM如纖維連接蛋白(FN)的合成,抑

5、制ECM的降解,參與腎小球硬化的過程。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族主要成員,是胞內(nèi)介導胞外刺激的重要信號系統(tǒng)之一,其包括兩個高度同源的亞類ERK1/ERK2,通過磷酸化修飾而被激活。激活的ERK將外界信號傳導到細胞核內(nèi),參與細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡等多種生理反應(yīng)的過程。另有研究發(fā)現(xiàn),大鼠系膜細胞轉(zhuǎn)染megsin基因后,可見PDGF-BBmRNA的表達,其TGF-β1mRNA的表達也顯著上調(diào),兩者與轉(zhuǎn)染megsin基因呈時

6、間依賴關(guān)系。也就是說大鼠系膜細胞轉(zhuǎn)染megsin基因后,可刺激細胞PDGF-BB、TGF-β1的分泌,從而推測在DN發(fā)生、發(fā)展過程中,megsin與PDGF—BB、TGF-β1之間勢必存在著密切聯(lián)系,但megsin與ERK之間是否存在聯(lián)系目前尚未知曉。
　　 本研究擬通過體外培養(yǎng)腎小球系膜細胞,對系膜細胞megsin基因的表達進行干預,探討高糖環(huán)境中過表達megsin基因的小鼠腎小球系膜細胞合成ECM的變化,以及經(jīng)高糖刺激后過表

7、達megsin基因的腎小球系膜細胞可能的信號傳導途徑。進一步研究在高糖環(huán)境中,megsin基因是否會通過PDGF-BB影響ERK通路從而促進系膜細胞增生和ECM積聚,希望能夠進一步揭示DN的發(fā)病機制,為DN的防治提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:將培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細胞分為六組:即正常對照組(A組,D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖組(B組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+空質(zhì)粒組(C組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖

8、+megsin質(zhì)粒組(D組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin質(zhì)粒+ERK.通路抑制劑組(E組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+siRNA組(F組,D-葡萄糖30mmol/L)。大量提取己構(gòu)建的megsin表達質(zhì)粒、空質(zhì)粒和megsin siRNA表達質(zhì)粒,按實驗分組設(shè)計應(yīng)用脂質(zhì)體2000瞬時轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒(western blot法測定各組細胞megsin蛋白表達量以檢測轉(zhuǎn)染效率)并給予相應(yīng)刺激,分別在培養(yǎng)12、24、

9、48小時后,采用免疫細胞化學和western blot方法測定各組系膜細胞megsin、PDGF-BB、磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)、TGF—β1及FN的表達,RIA法測定各組細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(結(jié)果用總蛋白校正)。
　　 結(jié)果:免疫細胞化學結(jié)果顯示:在正常糖環(huán)境下,pERK1/2存在于系膜細胞的胞漿中,呈淺棕黃色,表達較弱；高糖刺激12h后可見pERK1/2由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移,且隨時間延長,胞核中表達逐漸增強,呈

10、深棕黃色強表達,且胞漿中表達也明顯高于正常組(P<0.05)；高糖環(huán)境下,系膜細胞轉(zhuǎn)染megsin基因后此種趨勢更顯著。應(yīng)用ERK通路抑制劑后,pERK1/2于胞漿、胞核中的表達均被明顯抑制。從12h開始,B組較A組小鼠系膜細胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平開始升高,48h達到高峰(P<0.05)；C組和B組同期相比差異無顯著性(P>0.05)；D組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、

11、pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平升高,差異有顯著性意義(P<0.05)；E組與D組同期相比,megsin和PDGF-BB的表達無明顯變化(P>0.05),pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平下降,差異有顯著性意義(P<0.05)；F組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF—β1和FN蛋白水平降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 Western blot結(jié)果顯示:從12h開始

12、,B組較A組小鼠系膜細胞megsin、PDGF—BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平開始升高,48h達到高峰(P<0.05)；C組和B組同期相比差異無顯著性(P>0.05)； D組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平升高,差異有顯著性意義(P<0.05)；E組與D組同期相比,megsin和PDGF-BB的表達無明顯變化(P>0.05),pERK1/2和TGF-β1蛋白水平下降,差異有顯

13、著性意義(P<0.05)；F組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 放射免疫測定顯示:從12h開始,B組小鼠系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(細胞總蛋白濃度校正)較A組開始升高,48h達到高峰(P<0.05)；C組與B組同期相比差異無顯著性(P>0.05)；D組與B組同期相比,系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度升高,差異有顯著性意義(P<0.05)

14、；E組與D組同期相比,系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。F組與B組同期相比,系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:體外實驗證實,高糖環(huán)境下小鼠系膜細胞ERK通路活化,megsin、PDGF—BB、TGF—β1、Ⅳ型膠原及FN的表達增加。高糖環(huán)境下過表達megsin基因可進一步上調(diào)系膜細PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、Ⅳ型膠原及FN的表達。