SUMO化修飾對(duì)高糖刺激的腎系膜細(xì)胞TGF-β-Smad信號(hào)通路的調(diào)控研究.pdf

1、 目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病特有而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,晚期以腎小球硬化和腎小管腎間質(zhì)纖維化為主要病理改變。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是致纖維化的關(guān)鍵信號(hào)分子,而 TGF-β/Smad 通路是介導(dǎo)糖尿病腎病后期纖維化的重要信號(hào)通路。目前已公認(rèn)TGF-β信號(hào)通路受到磷酸化、泛素化等翻譯后修飾調(diào)節(jié),近年研究顯示該通路還受到小泛素相

2、關(guān)修飾物( small ubiquitin related modifier, SUMO)化調(diào)節(jié)。SUMO及其特異性酶可通過修飾TGF-β通路中某些重要信號(hào)分子如：TGF-βI型受體( type I TGF-βreceptor,TβRⅠ)、Smad4等對(duì)該通路進(jìn)行調(diào)控。既然SUMO化修飾對(duì)TGF-β信號(hào)通路有重要的調(diào)控作用,而TGF-β通路又是糖尿病腎病致纖維化的關(guān)鍵通路,那么SUMO化修飾是否參與了糖尿病腎病TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控值

3、得研究。為此,本研究觀察高糖刺激下大鼠腎小球系膜細(xì)胞中SUMO與Smad4蛋白的表達(dá)及二者之間的相互作用,探討 SUMO 化修飾在糖尿病腎病 TGF-β信號(hào)通路中的作用與機(jī)制。方法：高糖作為刺激因子,將體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(Glomerular Mesangial Cells,GMCs)分為5個(gè)組：正常對(duì)照組(NC組,培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖)； 10 mmol/L高糖組(HG1組,培養(yǎng)基含10 mmol/L葡萄糖)；20

4、 mmol/L高糖組(HG2組,培養(yǎng)基含20 mmol/L葡萄糖)；30 mmol/L高糖組(HG3組,培養(yǎng)基含30 mmol/L葡萄糖)；滲透壓對(duì)照組(OP組,培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖 +24.4 mmol/L甘露醇),將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)6h、12 h、24 h后用于實(shí)驗(yàn)。用Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞SUMO(SUMO1、SUMO2/3、SUMO4)和Smad4蛋白表達(dá),RT-PCR檢測(cè)SUMO和纖維連接蛋白(fi

5、bronectin,FN)mRNA表達(dá)；免疫共沉淀和免疫熒光雙染技術(shù)分別檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞中SUMO與 Smad4 蛋白間的相互作用及共定位關(guān)系。結(jié)果：1、與正常組比較,各高糖組SUMO1、SUMO2/3和Smad4蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05),呈一定濃度依賴性；與正常組比較,高糖作用6h后SUMO1、SUMO2/3和Smad4蛋白表達(dá)無明顯變化,作用12h、24h后表達(dá)逐漸增加(P<0.05)；SUMO1和Smad4表達(dá)在滲透壓組與

6、正常組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),SUMO2/3 滲透壓組較正常組表達(dá)有所增加,但明顯低于 20mmol/L 和 30mmol/L 葡萄糖組(P<0.05)；SUMO4在大鼠腎系膜細(xì)胞中不表達(dá)；2、免疫共沉淀結(jié)果顯示腎小球系膜細(xì)胞SUMO2/3與Smad4在各組均存在相互作用,并在高糖刺激后顯著增強(qiáng)(P<0.05),而SUMO1與Smad4間無相互結(jié)合作用；3、免疫熒光雙染結(jié)果表明SUMO2/3與smad4在腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)存在

7、共定位現(xiàn)象,且在高糖組更明顯；4、與正常組比較,各高糖組SUMO1、SUMO2/3和FN mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05),呈一定濃度依賴性；與正常組比較,高糖作用12h、24h后SUMO1、SUMO2/3和FN mRNA表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。 結(jié)論： 1.高糖可誘導(dǎo)腎系膜細(xì)胞SUMO和FN表達(dá)增強(qiáng),提示 SUMO 在糖尿病腎病纖維化發(fā)病中可能有重要作用； 2.SUMO2/3共價(jià)修飾Smad4參與糖尿病腎病時(shí)TGF-β信號(hào)通