TGF-β-Smad信號(hào)對(duì)人橫紋肌肉瘤細(xì)胞RD生長(zhǎng)和凋亡調(diào)控的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)是一種多功能的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)形成、細(xì)胞移動(dòng)、粘附、胚胎發(fā)育、組織器官形態(tài)發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。TGF-β通過(guò)與細(xì)胞膜受體結(jié)合，將信號(hào)傳遞到下游分子Smad，磷酸化的Smad分子入核，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)控具有細(xì)胞類型的特異性。TGF-β/Smad信號(hào)的喪失或轉(zhuǎn)導(dǎo)異常常與

2、腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)。目前，對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的研究主要集中在上皮性腫瘤和血液腫瘤上，對(duì)其在軟組織腫瘤中的調(diào)控作用及機(jī)制的研究國(guó)內(nèi)外均少見報(bào)道。 橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma，RMS)是兒童期常見的軟組織腫瘤。其發(fā)病率一般占軟組織惡性腫瘤的10～20％。RMS生長(zhǎng)迅速，易早期發(fā)生血道轉(zhuǎn)移，盡管采取手術(shù)治療和聯(lián)合放化療，有轉(zhuǎn)移發(fā)生的患者約90％以上在5年內(nèi)死亡。RMS可以產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子，其介導(dǎo)的異常信

3、號(hào)與RMS細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡有關(guān)。明確這些生長(zhǎng)因子如何對(duì)RMS細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控將為腫瘤的治療提供新的思路和策略。 本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)：腺泡狀橫紋肌肉瘤和胚胎性橫紋肌肉瘤組織均表達(dá)TGF-β1，TGF-βⅠ型、Ⅱ型受體和下游Smad分子；RD細(xì)胞可以自分泌TGF-β1，表達(dá)TGF-βⅠ型、Ⅱ型受體及下游分子Smads，并證實(shí)TGF-β/Smad信號(hào)通路存在于RD細(xì)胞中。為研究TGF-β/Smad信號(hào)對(duì)RD細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)控作

4、用及其機(jī)制，我們采用小分子RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，特異性封閉TGF-β/Smad信號(hào)通路上中樞性傳遞因子Smad4的表達(dá)以阻礙信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)；并給以外源性、較高濃度TGF-β1刺激細(xì)胞，分別檢測(cè)內(nèi)源性和外源性TGF-β/Smad信號(hào)對(duì)RD細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的調(diào)控。并對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)在調(diào)控RD細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制上作深入研究。獲如下主要結(jié)果： 1.以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為載體，將生物合成的shRNA(s

5、horthairpinRNA，shRNA)轉(zhuǎn)入RD細(xì)胞。采用RT-PCR和Westernblot檢驗(yàn)shRNA對(duì)Smad4的封閉效果，5條shRNA鏈中，Y1鏈具有最佳干擾效果，自轉(zhuǎn)入細(xì)胞12小時(shí)起，在96小時(shí)內(nèi)可有效發(fā)揮封閉RD細(xì)胞中Smad4mRNA和蛋白表達(dá)的作用；采用免疫熒光化學(xué)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：TGF-β1刺激經(jīng)shRNA干擾的RD細(xì)胞，胞質(zhì)中的Smad2/3入核明顯減少，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻。提示：RNAi技術(shù)可有效

6、封閉Smad4的表達(dá)；Smad4表達(dá)的抑制可以在一定程度上阻斷TGF-β/Smad信號(hào)在RD細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 2.應(yīng)用3H-thymidine摻入實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源性TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻或外源性TGF-β1刺激對(duì)RD細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)RNA干擾組，RNA干擾加TGF-β1刺激組及TGF-β1刺激組，細(xì)胞生長(zhǎng)活力均低于正常對(duì)照組，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)對(duì)RD細(xì)胞周期的

7、影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻和外源性的TGF-β1刺激均可導(dǎo)致RD細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期的停滯。通過(guò)電鏡檢測(cè)以及激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞Dapi染色的觀測(cè)，均發(fā)現(xiàn)RNA干擾組和RNA干擾加TGF-β1組有明顯的凋亡小體形成。在分子水平上，流式細(xì)胞術(shù)和DNA片段檢測(cè)也證實(shí)在RNA干擾組和RNA干擾加TGF-β1組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。提示：通過(guò)RNAi技術(shù)使TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻導(dǎo)致RD細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，并誘導(dǎo)細(xì)胞

8、凋亡；外源性、較高濃度的TGF-β1可以抑制RD細(xì)胞的生長(zhǎng)，但并不誘導(dǎo)凋亡。 3.RT-PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：TGF-β1在mRNA和蛋白水平上調(diào)P27、P21，下調(diào)C-myc的表達(dá)。而對(duì)P15，CDK2和CDK4的表達(dá)無(wú)明顯影響。免疫共沉淀和體外激酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1上調(diào)P27的表達(dá)促使結(jié)合到CyclinE-cdk2復(fù)合體上的P27增加，從而抑制CDK2的磷酸化激酶活性。而與CyclinD-cdk4，

9、CyclinE-cdk2復(fù)合體結(jié)合的P21蛋白無(wú)明顯增加。CDK4的磷酸化激酶活性也未受到明顯抑制。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示：TGF-β1可促使RD細(xì)胞中P27出現(xiàn)伴隨熒光強(qiáng)度增加的核周聚集現(xiàn)象。TGF-β1刺激還可導(dǎo)致胞核表達(dá)的P21彌散到胞質(zhì)。 以上研究結(jié)果提示，在生理濃度下，TGF-β1/Smad信號(hào)是維持RD細(xì)胞生長(zhǎng)所必需。阻礙內(nèi)源性TGF-β1/Smad信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)不但抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。外源性、較