Megsin基因?qū)Ω咛黔h(huán)境下小鼠腎臟系膜細(xì)胞EMMPRIN、MMP-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,它已成為終末期腎功能衰竭(end-stage renalfailer,ESRF)的主要因?yàn)橹?因此探索DN的發(fā)病機(jī)制及防治策略成為目前廣大腎臟病學(xué)者關(guān)注的課題。DN的發(fā)病受多種因素影響,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解、合成失調(diào)和重塑導(dǎo)致的腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化是DN的主要病理表現(xiàn),其中調(diào)

2、控ECM代謝的ECM降解酶類的表達(dá)與活性異常發(fā)揮著重要的作用。
　　 Miyata等從人系膜細(xì)胞的基因表達(dá)庫中分離出一種在系膜細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)的基因Megsin(mesangial cell-predominant gene with a homology toserpin),屬絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族。已有研究發(fā)現(xiàn),其在以系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)積聚為主要病理改變的糖尿病腎病中,其基因與蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。Megsin基因與蛋白的

3、表達(dá)上調(diào)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用尚不完全清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是調(diào)控腎臟ECM代謝的一個(gè)重要的降解系統(tǒng),包括明膠酶、間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)溶素、彈力蛋白酶以及分泌型和膜型MMP等,它們的活性均依賴鋅離子,活化的基質(zhì)金屬蛋白酶可以協(xié)同地降解多種ECM成分,其中MMP-2、MMP-9是起關(guān)鍵作用的酶。最近Ohtomo等研究發(fā)現(xiàn),megsin能抑制MMP-2、MMP-9和纖溶酶的活性

4、,megsin的特異性單克隆中和抗體能增強(qiáng)上述三者的活性,且作用機(jī)制與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)無直接關(guān)系。故探討megsin在細(xì)胞外基質(zhì)代謝中的作用對(duì)于深入揭示糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。
　　 本研究擬通過體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞(Mc),并采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),對(duì)系膜細(xì)胞megsin基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù),觀察高糖環(huán)境中megsin過表達(dá)和抑制狀態(tài)下小鼠Mc中megsin、EMMPRIN、MMP-2、Ⅴ型膠原表達(dá)水平的變化,

5、探討高糖環(huán)境Fmegsin基因在ECM代謝過程中的作用,為進(jìn)一步揭示糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及尋找早期防治方法提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 方法:將培養(yǎng)的小鼠腎小球Mc隨機(jī)分為五組:即正常對(duì)照組:(A組,D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖組:(B組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+空質(zhì)粒組(C組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin質(zhì)粒組:(D組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin siRNA組:(E組

6、,D-葡萄糖30mmol/L)。大量提取已構(gòu)建的空質(zhì)粒、過表達(dá)megsin質(zhì)粒和表達(dá)megsin siRNA質(zhì)粒,按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)應(yīng)用脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒(western blot法測定各組細(xì)胞megsin蛋白表達(dá)量以檢測轉(zhuǎn)染效率)并給予相應(yīng)刺激,分別在培養(yǎng)12、24、48小時(shí)后收集細(xì)胞,采用免疫細(xì)胞化學(xué)和蛋白印跡(Western blot)方法測定Megsin、EMMPRIN、MMP-2的表達(dá)情況,用放免法測定各組細(xì)胞上清中Ⅳ

7、型膠原的含量(結(jié)果用總蛋白校正)。
　　 結(jié)果:1免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:megsin表達(dá)于系膜細(xì)胞的胞漿中,A組有微弱表達(dá),呈淺棕黃色。各時(shí)間點(diǎn),B組megsin蛋白的表達(dá)量較A組升高,隨時(shí)間延長表達(dá)逐漸增強(qiáng),(p<0.01)；C組與B組相比差異無顯著性(P>0.05)；與同時(shí)期C組相比,D組megsin蛋白水平升高明顯,呈深棕黃色強(qiáng)表達(dá),差異有顯著性(p<0.01),E組megsin蛋白水平降低明顯,差異有顯著性(p<0.01

8、)。EMMPRIN和MMP-2表達(dá)于系膜細(xì)胞的胞漿中,A組呈深棕黃色強(qiáng)表達(dá)。各時(shí)間點(diǎn),B組EMMPRIN、MMP-2蛋白的表達(dá)量較A組降低,且隨時(shí)間延長其表達(dá)被抑制(p<0.01),C組與B組相比差異無顯著性(P>0.05)；與同時(shí)期C組相比,D組EMMPRIN、MMP-2蛋白水平降低明顯,有微弱表達(dá),呈淺棕黃色,差異有顯著性(p<0.01)；E組EMMPRIN、MMP-2蛋白水平升高明顯,差異有顯著性(p<0.01)。
　　

9、2 Western blot結(jié)果顯示:megsin在A組有少量表達(dá),各時(shí)間點(diǎn),B組的表達(dá)量較A組升高,且隨時(shí)間延長其表達(dá)呈上升趨勢(p<0.01)；C組與B組相比差異無顯著性(P>0.05)；與同時(shí)期C組相比,D組megsin升高明顯,差異有顯著性(p<0.01),E組megsin降低明顯,差異有顯著性(p<0.01)。EMMPRIN和MMP-2在A組有大量表達(dá),各時(shí)間點(diǎn),B組EMMPR/N、MMP-2蛋白的表達(dá)量較A組降低,且隨時(shí)間延

10、長其表達(dá)呈下降趨勢(p<0.01),48h時(shí)EMMPRIN、MMP-2水平降至最低；C組與B組相比差異無顯著性fP>0.05)；與同時(shí)期C組相比,D組EMMPRIN、MMP-2水平降低明顯,差異有顯著性(p<0.01),E組EMMPRIN、MMP-2水平升高明顯,差異有顯著性(P<0.01)。
　　 3放免法檢測細(xì)胞上清液Ⅳ型膠原從12h開始,B組小鼠系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(細(xì)胞總蛋白濃度校正)較A組開始升高,48h達(dá)到高

11、峰(P<0.01)；C組與B組相比差異無顯著性(P>0.05)；與同時(shí)期C組相比,D組Ⅳ型膠原濃度升高明顯,差異有顯著性(P<0.01),E組Ⅳ型膠原濃度降低明顯,差異有顯著性(P<0.01)。
　　 結(jié)論:1體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),高糖環(huán)境下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中megsin的表達(dá)增高,EMMPRIN和MMP-2表達(dá)降低,提示megsin、EMMPRIN和MMP-2在DN發(fā)生機(jī)制中起一定作用。
　　 2高糖狀態(tài)下,系膜細(xì)胞過表達(dá)meg

12、sin導(dǎo)致EMMPRIN和MMP-2的表達(dá)下降,Ⅳ型膠原增加；轉(zhuǎn)染megsin siRNA質(zhì)粒對(duì)megsin基因進(jìn)行干擾后megsin的表達(dá)降低,EMMPRIN和MMP-2的表達(dá)上升,Ⅳ型膠原減少。提示megsin促進(jìn)早期DN發(fā)生的機(jī)制可能部分通過EMMPRIN影響MMP-2的表達(dá),抑制Ⅳ型膠原降解,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性堆積。
　　 3應(yīng)用megsin RNA干擾技術(shù)可以緩解細(xì)胞外基質(zhì)積聚的病理過程,為人類早期DN的防治提供