高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細胞Gremlin表達的變化及吡格列酮對其干預的研究.pdf

1、目的:糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetesmellitus，DM)常見而嚴重的并發(fā)癥，是導致終末期腎衰竭的主要原因，因此探索DN的發(fā)病機制和防治策略是廣大腎臟病學者熱切關注的課題。gremlin是半胱氨酸結超家族的成員之一，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2/4/7內(nèi)源性拮抗劑，近年研究顯示gremlin與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展可能有密切關系，值得進一步研究探討，為糖尿病腎病的防治尋找新的干預途

2、徑。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)進展性糖尿病腎病患者腎活檢標本gremlin mRNA和蛋白表達明顯上調(diào)，尤其是小管間質(zhì)纖維化區(qū)域，并同轉化生長因子-β1(TGF-β1)分布相同。1型糖尿病STZ小鼠模型敲除grem1基因(grem1+/-)能抑制糖尿病腎病進展。抑制gremlin表達和維持BMP-7活性對糖尿病腎病具有保護作用。以上實驗數(shù)據(jù)也表明gremlin參與了糖尿病腎病發(fā)病。我們課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)體外高糖環(huán)境下小鼠系膜細胞胞外

3、調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase ERK1/2)通路被激活。ERK通路調(diào)控許多轉錄因子，控制細胞生長和細胞外基質(zhì)聚集。高糖培養(yǎng)下的牛視網(wǎng)膜外膜細胞體外實驗和STZ誘導的糖尿病小鼠模型的視網(wǎng)膜體內(nèi)實驗均表明高糖環(huán)境下激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase MAPK)，并且MAPK可影響gremlin基因表達。因而，

4、ERK激活可能是高糖導致腎小球損傷的重要因素。有研究證實，吡格列酮可通過PPAR-γ通路抑制小鼠腎小球系膜細胞AP-1和TGF-β1及其下游fibronectin合成，還可抑制高糖環(huán)境下系膜細胞DAG-PKC-ERK旁路的激活可能在延緩DN發(fā)生發(fā)展方面有一定的干預作用。
　　 目前有關gremlin在糖尿病腎病中的作用研究尚少。我們課題組前期研究已證實，gremlin可促進體外高糖環(huán)境下小鼠系膜細胞增生及細胞外基質(zhì)(extrac

5、ellular matrix EMC)合成聚集，然而，gremlin和TGF-β1、結締組織生長因子(connective tissue growth factor CTGF)之間具體復雜的相互作用機制，gremlin是否通過ERK1/2信號傳導通路參與糖尿病腎病發(fā)病以及吡格列酮對gremlin是否有干預作用，尚未見報道。
　　 本實驗擬通過體外實驗，采用基因轉染(gene transfection)，RNA干擾(RNA int

6、erference)和吡格列酮藥物干預方法，分子生物學檢測手段，對體外高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細胞gremlin基因的表達進行干預，觀察高糖環(huán)境中gremlin過表達和抑制狀態(tài)下腎小球系膜細胞中gremlin、pErk1/2、TGF-β1、CTGF、Ⅳ型膠原表達的變化及高糖環(huán)境下gremlin基因在EMC代謝中的作用，為進一步揭示糖尿病腎病發(fā)病的分子學機制及尋找早期防治方法提供實驗性理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、G

7、remlin基因轉染對高糖環(huán)境中系膜細胞胞外調(diào)節(jié)激酶表達的影響。
　　 1)小鼠系膜細胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒瞬時轉染；
　　 小鼠腎小球系膜細胞生長條件DMEM/F12(Gibco)含有10％FBS，Penicillin(100u/ml),Streptomycin(100ug/ml),37℃,5％CO2-95％air。六孔板，每孔細胞數(shù)2x106，或不加抗生素，培養(yǎng)24小時。用Lipofectanine2000 reagent(

8、Invitrogen)轉染pEGFP-N1和pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒。脂質(zhì)體2000瞬時轉染方法嚴格按照LipofectamineTM2000說明書方法進行。質(zhì)粒轉染24小時后，細胞進一步在DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(HG;30 mM)或正常糖培養(yǎng)基(NG;5.5 mM)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24小時。提取六孔板培養(yǎng)細胞蛋白及RNA。
　　 2)小鼠系膜細胞分組及相關指標的檢測；
　　 小鼠腎小球系膜細胞分成4個實驗組，

9、即正常對照組(NG組，非轉染的系膜細胞，D-葡萄糖5.5mmol/l)、高糖組(HG組，非轉染的系膜細胞，D-葡萄糖30mmol/l)、高糖+空質(zhì)粒組(HG+Ⅴ組，脂質(zhì)體2000轉染pEGFP-N1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l)、高糖+質(zhì)粒轉染組(HG+P組，脂質(zhì)體2000轉染pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l)。按分組情況給予高糖刺激，以開始給予高糖刺激定為“0”時，計算各組刺激時間。于24 h末收集細胞

10、，免疫細胞化學檢測PCNA蛋白的表達，Westernblot檢測gremlin、pErk1/2、TGF-β1和CTGF蛋白的表達，實時定量PCR（RT-PCR）檢測gremlin mRNA的表達，及放射免疫法(RIA)測定各組細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結果用總蛋白校正）。
　　 2、Gremlin shRNA基因轉染對高糖環(huán)境中系膜細胞胞外調(diào)節(jié)激酶表達的影響。
　　 1)小鼠系膜細胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒轉染；
　　 小鼠

11、腎小球系膜細胞生長條件DMEM/F12(Gibco)含有10％FBS，Penicillin(100u/ml), Streptomycin(100ug/ml),37C,5％CO2-95％air。六孔板，每孔細胞數(shù)2x106，或不加抗生素，培養(yǎng)24小時。用Lipofectanine2000 reagent(Invitrogen)轉染pGenesil1.1和pGenesil1.1-shGrem1質(zhì)粒。脂質(zhì)體2000瞬時轉染方法嚴格按照Lipo

12、feetamineTM2000說明書方法進行。質(zhì)粒轉染24小時后，細胞進一步在DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(HG;30mM)或正常糖培養(yǎng)基(NG;5.5 mM)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24小時。提取六孔板培養(yǎng)細胞蛋白及RNA。
　　 2)小鼠系膜細胞分組及相關指標的檢測；
　　 小鼠腎小球系膜細胞分成4個實驗組，即正常對照組（NG組，非轉染的系膜細胞，D-葡萄糖5.5mmol/l）、高糖組(HG組，非轉染的系膜細胞，D-葡萄糖30m

13、mol/l)、高糖+空質(zhì)粒組（HG+Ⅴ組，脂質(zhì)體2000轉染pGenesil1.1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l）、高糖+shRNA基因轉染組(HG+SH組，脂質(zhì)體2000轉染pGenesil1.1-shGrem1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l)。按分組情況給予高糖刺激，以開始給予高糖刺激定為“0”時，計算各組刺激時間。于24 h末收集細胞，免疫細胞化學檢測PCNA蛋白的表達，Western blot檢測gremlin、pErk1/

14、2、TGF-β1和CTGF蛋白的表達，實時定量PCR(RT-PCR)檢測gremlin mRNA的表達，及放射免疫法(RIA)測定各組細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結果用總蛋白校正）。
　　 3、吡格列酮對高糖環(huán)境下系膜細胞gremlin表達的影響。
　　 將小鼠腎小球系膜細胞分為4組:正常對照組(A組，D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖組（B組，D-葡萄糖30mmol/L）、高糖+吡格列酮組(C組，吡格列酮:10μmol

15、/L)、高糖+PD98059組(D組，PD98059∶20μmol/L)，刺激24小時后，免疫細胞化學檢測PCNA蛋白的表達，Western blot檢測gremlin、pErk1/2、TGF-β1和CTGF蛋白的表達，實時定量PCR(RT-PCR)檢測gremlin mRNA的表達，及放射免疫法(RIA)測定各組細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結果用總蛋白校正）。
　　 結果:
　　 1、Gremlin基因轉染對高糖環(huán)境中系

16、膜細胞胞外調(diào)節(jié)激酶表達的影響。
　　 ①免疫細胞化學結果:正常對照組PCNA蛋白在小鼠系膜細胞的細胞核內(nèi)有基礎量的表達，高糖刺激后，表達信號呈強陽性，陽性細胞所占比例也明顯的增加，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組較高糖組無明顯變化，高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒轉染組較高糖組表達進一步增高，說明轉染pEGFP-N1-Greml質(zhì)粒進一步促進高糖刺激導致的小鼠系膜細胞的增殖;②Western blot結果:高糖刺激組greml

17、in、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表達較正常對照組增高，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組較高糖組無明顯變化，高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒轉染組這四者表達較高糖組進一步升高;③RT-PCR結果:高糖刺激組gremlin mRNA水平表達較正常對照組增高，趨勢與Western blot結果大致相同，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組較高糖組無明顯變化，高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒轉染組gremlin mRNA表達較高糖組

18、進一步升高;④放射免疫結果顯示:與正常對照組相比，高糖組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度升高(P＜0.01);與高糖組相比，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組上述指標無明顯變化（均P＞0.05）;高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較高糖組升高(P＜0.01)，說明轉染pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒進一步促進高糖刺激導致的Ⅳ型膠原聚集。
　　 2、Gremlin shRNA基因轉染對高糖環(huán)境中系膜細胞胞外調(diào)節(jié)

19、激酶表達的影響。
　　 ①免疫細胞化學結果:正常對照組PCNA蛋白在小鼠系膜細胞的細胞核內(nèi)有基礎量的表達，高糖刺激后，表達信號呈強陽性，陽性細胞所占比例也明顯的增加，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組較高糖組無明顯變化，高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉染組較高糖組表達明顯降低，說明轉染pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒抑制了高糖刺激導致的小鼠系膜細胞增殖;②Western blot結果:高糖刺激組greml

20、in、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表達較正常對照組增高，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組較高糖組無明顯變化，高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉染組較高糖組表達明顯降低;③RT-PCR結果:高糖刺激組gremlin mRNA水平表達較正常對照組增高，趨勢與Western blot結果大致相同，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組較高糖組無明顯變化，高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉染組較高糖組表達明顯

21、降低。④放射免疫結果顯示:與正常對照組相比，高糖組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度升高（P＜0.01）;與高糖組相比，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組上述指標無明顯變化（均P＞0.05）;高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較高糖組降低(P＜0.01)，說明pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉染促進了Ⅳ型膠原降解。
　　 3、吡格列酮對高糖環(huán)境下系膜細胞gremlin表達的影響。
　

22、　 ①免疫細胞化學結果:正常對照組PCNA蛋白在小鼠系膜細胞的細胞核內(nèi)有基礎量的表達，高糖刺激后，表達信號呈強陽性，陽性細胞所占比例也明顯的增加，高糖+吡格列酮組及高糖+PD98059組較高糖組表達明顯降低，說明吡格列酮及PD98059抑制了高糖刺激所致的小鼠系膜細胞增殖;②Western blot結果:高糖刺激組gremlin、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表達較正常對照組增高，高糖+吡格列酮組及高糖+PD98059組較高糖

23、組表達明顯降低;③RT-PCR結果:高糖刺激組gremlin mRNA水平表達較正常對照組增高，趨勢與Western blot結果大致相同，高糖+吡格列酮組及高糖+PD98059組較高糖組表達明顯降低;④放射免疫結果顯示:高糖組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較正常對照組升高(P＜0.01)，高糖+吡格列酮組(10μmol/L)和高糖+PD98059組（20μmol/L）組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較高糖組降低（P＜0.01），說明吡格列酮及

24、PD98059促進了Ⅳ型膠原的降解。
　　 結論:
　　 1、轉染gremlin基因可促進高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細胞gremlin表達，促進gremlin表達后又可增加pERK1/2、TGF-β1、CTGF和Ⅳ型膠原表達，提示gremlin基因可能通過激活高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細ERK1/2通路促進TGF-β1、CTGF表達及Ⅳ型膠原聚集，提示gremlin基因可能參與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展。
　　 2、轉染gr

25、emlin shRNA基因可抑制高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細胞gremlin表達，抑制gremlin表達后又可下調(diào)pERK1/2、TGF-β1、CTGF、Ⅳ型膠原表達，提示gremlin shRNA基因可能通過抑制高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細胞ERK1/2通路激活阻礙TGF-β1、CTGF表達及Ⅳ型膠原聚集，提示gremlin shRNA基因可能對糖尿病腎病有保護作用。
　　 3、吡格列酮可抑制高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細胞中grem