Benazepril Hydrochloride對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞ILK、α-SMA表達(dá)的影響及意義.pdf

1、目的：觀察高糖培養(yǎng)下腎小球系膜細(xì)胞對(duì)ILK的表達(dá)以及Benazepril對(duì)ILK的表達(dá)的干預(yù)作用。目前糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已經(jīng)成為在美國(guó)和歐洲引起終末期腎病(ESRD)最常見的原因，是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，但是迄今為止DN的發(fā)病和早期預(yù)防措施并不明確。DN主要的病理改變是：腎小球基底膜增厚、腎小球系膜細(xì)胞(Glomerular mesangial cell，GMC)增殖與系膜基質(zhì)的積聚，最終導(dǎo)

2、致腎小球硬化。GMC是腎小球中最活躍的細(xì)胞，對(duì)于維持腎臟正常組織結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)揮著重要作用，因此積極探討GMC在生理、病理下的變化機(jī)制對(duì)于臨床DN的防治和早期發(fā)現(xiàn)具有重大而深遠(yuǎn)的的意義。 整合素連接激酶(Intergrin-linked Kinase，ILK)是一種存在于細(xì)胞胞漿中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括整合素、生長(zhǎng)因子及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、維持細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡、控制細(xì)胞

3、形態(tài)和基因的表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)正常的腎臟組織中ILK在GMC表達(dá)較弱或幾乎不表達(dá)，但I(xiàn)LK表達(dá)的增高常伴隨GMC細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分泌。α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是血管平滑肌特有的細(xì)胞骨架蛋白，即血管平滑肌的標(biāo)志，正常成熟的GMC是不表達(dá)的。但在病理情況下GMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化可表達(dá)α-SMA，其表達(dá)情況和GMC增殖改變，細(xì)胞外基質(zhì)的積聚

4、，腎功能持續(xù)下降密切聯(lián)系。而DN早期病理改變主要就是GMC增殖肥大和ECM積聚，因此探討ILK、α-SMA與GMC增殖及ECM分泌的關(guān)系，可以更加深入闡明DN的發(fā)病機(jī)制。 Benazepril(貝那普利)是新一代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，它通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，使循環(huán)和組織中血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)減少，并同時(shí)減少Ang Ⅱ的刺激，阻止其與受體AT1結(jié)合。有實(shí)驗(yàn)證明高糖刺激下的GMC可自分泌Ang Ⅱ，后者和GMC膜上A

5、T1結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致了GMC內(nèi)PKC等通路的活化，引起一些其他細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因和蛋白的異常表達(dá)，致使GMC增殖和分化。本實(shí)驗(yàn)利用貝那普利進(jìn)行干預(yù)，觀察ILK、α-SMA在高糖培養(yǎng)GMC的表達(dá)及藥物的保護(hù)作用，為臨床DN防治提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。 方法：腎小球系膜細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)消化傳代，將其隨機(jī)分為四組：即正常糖對(duì)照組(D-葡萄糖5.5mmol/L，NG組)、甘露醇組(甘露醇20mmol/L，MG組)、高糖組(D-葡萄糖30 mmol

6、/L，HG組)、高糖+Benazepril干預(yù)組(D-葡萄糖30mmol/L+唄那普利10μmol/L，HG+Benazepril)分別培養(yǎng)。四組于實(shí)驗(yàn)開始后3、6、12、24、48、72h收集細(xì)胞，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)GMC中ILK、α-SMA mRNA的表達(dá)，用western blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組GMC中ILK、α-SMA蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1.細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果：倒置相差顯微鏡下可見MC呈梭形、不規(guī)則

7、星形或三角形的、樹枝形，當(dāng)細(xì)胞密集時(shí)可重疊生長(zhǎng)，胞漿多突起，有大量微絲樣結(jié)構(gòu)，核居中央，多呈圓形或橢圓形； 2.高糖環(huán)境中GMC ILK mRNA和蛋白水平3h時(shí)較正常糖組明顯升高(P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)有增高趨勢(shì)(P<0.05)，表達(dá)量在48h達(dá)到最高(P<0.05)，但在72h開始下降(P<0.05)。藥物干預(yù)后上述指標(biāo)較高糖組表達(dá)水平下降，但未能恢復(fù)至對(duì)正常照組水平(P<0.01)；同時(shí)間點(diǎn)甘露醇組ILK mRNA和蛋白水平

8、與正常糖組無明顯差別(P>0.05)。3.高糖環(huán)境中GMC α-SMA mRNA和蛋白水平較正常糖組升高(P<0.01)，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高(P<0.05)，表達(dá)量在72h達(dá)到最高(P<0.01)，藥物干預(yù)后上述指標(biāo)較高糖組表達(dá)水平下降(P<0.01)，但未能恢復(fù)至對(duì)照組水平(P<0.05)；同時(shí)間點(diǎn)甘露醇組α-SMA mRNA和蛋白水平與較正常糖組升高(P<0.05)，不能排除高糖組滲透壓依賴性引起的α-SMA升高。 結(jié)論：上