miR-101靶向調(diào)節(jié)AMPK表達(dá)抑制高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞自噬及促進(jìn)其增殖.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是全球范圍終末期腎臟病(End stagerenal disease，ESRD)的最主要死亡原因之一，其患病率日益增加。
　　腎小球系膜細(xì)胞(Glomerular mesangial cells，GMCs)是腎臟重要的固有細(xì)胞之一，具有維持腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)代謝平衡的重要作用。
　　自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對(duì)

2、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用。DN時(shí)，氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、缺氧等腎臟損傷因素在損傷腎臟的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，進(jìn)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)與存活，而高糖條件下可導(dǎo)致GMCs自噬功能受到抑制，從而加重了損傷因素對(duì)腎臟系膜細(xì)胞的損傷。然而，在糖尿病(DiabetesMellitus，DM)狀態(tài)下的腎臟組織中，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的損傷因素增多，具有細(xì)胞保護(hù)作用的自噬現(xiàn)象不但沒有代償性

3、增高，反而處于抑制狀態(tài)，這種損傷作用增強(qiáng)、保護(hù)作用減弱的矛盾提示，DM狀態(tài)下GMCs的自噬功能缺陷可能參與了DN的發(fā)生與發(fā)展，為我們探究DN的發(fā)病機(jī)制提供了新思路。
　　MicroRNAs是一種內(nèi)源性非編碼單鏈核苷酸，其長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸。microRNAs調(diào)節(jié)了細(xì)胞生長(zhǎng)，組織分化，參與多種細(xì)胞學(xué)行為，因而與生命過程中發(fā)育、疾病密切相關(guān)。現(xiàn)已證實(shí)microRNA的種子序列能通過完全或幾乎完全堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因mRN

4、A3'端非編碼區(qū)相結(jié)合從而引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miR-101是眾多microRNAs中的一員，近年來多有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-101能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞的自噬反應(yīng)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療藥物的敏感性，也有報(bào)道其表達(dá)量下降能在體內(nèi)或體外抑制腫瘤的生長(zhǎng)。Chigusa Higuchi等發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者(Type2 diabetes，T2D)血清中l(wèi)og10miR-101的濃度比正常糖耐量患者(

5、Normal glucosetolerance，NGT)明顯增高。miR-101在動(dòng)物體內(nèi)多種組織中的表達(dá)譜顯示，它在胰腺組織中高表達(dá)，而T2D組血清中高表達(dá)的miR-101除了來源于胰腺組織還是可能來源于其他組織？目前還不清楚。在腫瘤細(xì)胞中，miR-101能通過負(fù)性調(diào)控靶基因（如E2H2、STMN1、RAB5A、ATG4D等）的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的自噬反應(yīng)，增強(qiáng)其凋亡。在DN中，高糖可以抑制GMCs的自噬反應(yīng)，而miR-101在T2D患

6、者血清中的表達(dá)量升高，且它能夠靶向調(diào)控自噬基因，那么miR-101在DN的GMCs中是否表達(dá)增高，能否抑制GMCs的自噬反應(yīng)，從而影響DN的發(fā)生發(fā)展。
　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是真核生物中高度保守的能量感受器，廣泛表達(dá)于所有類型的腎臟細(xì)胞，其磷酸化活性降低與DN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，當(dāng)AMP/ATP比率升高時(shí)被激活，被認(rèn)為是糖尿病治療的有效新靶點(diǎn)之一。有報(bào)道證明:白

7、藜蘆醇可以通過對(duì)AMPK的激活減輕DN早期的腎臟損害。AMPK對(duì)自噬作用的調(diào)節(jié)也起到關(guān)鍵作用，在DN中，AMPK的活性受到抑制，GMCs的自噬功能減弱，而激活A(yù)MPK信號(hào)通路可以改善高糖誘導(dǎo)的GMCs自噬功能障礙。因此，高糖刺激下GMCs的AMPK磷酸化活性降低與自噬抑制有關(guān)，而激活A(yù)MPK可改善高糖刺激下系膜細(xì)胞的自噬功能。
　　本課題以小鼠腎小球系膜細(xì)胞株SV40 Mes作為研究對(duì)象，首先通過體外培養(yǎng)SV40 Mes細(xì)胞觀察高

8、糖對(duì)SV40 Mes細(xì)胞自噬、增殖能力及miR-101表達(dá)水平的影響，然后行雙熒光素酶檢測(cè)驗(yàn)證AMPK是否為miR-101的直接靶基因，利用qRT-PCR、Western blot法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-101對(duì)SV40 Mes細(xì)胞AMPK mRNA及蛋白水平的影響。最后研究高糖條件下miR-101對(duì)SV40 Mes細(xì)胞自噬、增殖能力的影響，旨在為DN的治療提供理論依據(jù)并尋找新思路。
　　本課題由以下兩個(gè)部分的研究組成:
　　

9、第一部分 高糖條件下小鼠腎小球系膜細(xì)胞自噬、增殖及miR-101表達(dá)量的關(guān)系，驗(yàn)證小鼠系膜細(xì)胞存在miR-101對(duì)AMPK的直接調(diào)控關(guān)系
　　目的：
　　1.觀察高糖對(duì)小鼠系膜細(xì)胞株SV40 Mes自噬、增殖能力及miR-101表達(dá)量的影響以及三者之間的關(guān)系;
　　2.驗(yàn)證SV40 Mes細(xì)胞中存在miR-101對(duì)AMPK的直接調(diào)控關(guān)系。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):采用含10％胎牛血清的1640低糖培養(yǎng)

10、基，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞株SV40 Mes。
　　2.用高糖(30mM)分別干預(yù)SV40 Mes0、24、48、72h，同時(shí)設(shè)對(duì)照組甘露醇組(30mM)。分組:正常糖組NG、甘露醇組Man、高糖組HG以及高糖干預(yù)時(shí)間梯度組:HG0h、HG24h、HG48h、HG72h共7組。檢測(cè)指標(biāo):a、用WB測(cè)各組細(xì)胞胞質(zhì)型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Cytosolic truncated form of LC3，

11、LC3BⅠ)、自噬體膜型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Autophagosomal membraneassociated form of LC3，LC3BⅡ)、AMPK、p-AMPK、PCNA的表達(dá)水平;b、用CCK8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖率;c、用qRT-PCR測(cè)各組細(xì)胞miR-101的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.高糖環(huán)境下SV40 Mes細(xì)胞自噬體形成標(biāo)志蛋白LC3B的自噬水平隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低;HG72h SV40

12、 Mes細(xì)胞LC3B蛋白的自噬水平最低。干預(yù)72h后，HG組SV40 Mes細(xì)胞LC3B蛋白的自噬水平較NG組顯著降低(P＜0.05);NG組與Man組SV40 Mes細(xì)胞LC3B蛋白的自噬水平未見明顯異常(P＞0.05)。
　　2.高糖刺激72小時(shí)(HG72h)后，SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白的含量較HG0h顯著增多(P＜0.05);高糖刺激其他時(shí)間點(diǎn)SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白的含量無明顯差異。干預(yù)72h后，HG組

13、SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)PCNA的含量較正常組顯著增高(P＜0.05); NG組與Man組SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)PCNA的含量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.高糖抑制SV40 Mes細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，其作用與滲透壓無關(guān);可見，在DM狀態(tài)的腎臟中，葡萄糖毒性損傷了GMCs的自噬功能。
　　2.高糖誘導(dǎo)SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白表達(dá)量增加，其作用與滲透壓無關(guān);高糖促進(jìn)SV40 Mes細(xì)胞的

14、增殖。
　　3.高糖使SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)miR-101的表達(dá)量增加，其作用與滲透壓無關(guān)。
　　4.在高糖誘導(dǎo)SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)miR-101表達(dá)量增加中，自噬減弱、增殖能力增強(qiáng)與miR-101增加有關(guān)。
　　5.高糖誘導(dǎo)SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)AMPK的蛋白表達(dá)水平與miR-101的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。
　　6.miR-101的種子序列能與AMPK-3'UTR直接結(jié)合并降低AMPK mRNA及蛋白的表達(dá)水平。<

15、br>　　7.miR-101可能通過調(diào)控AMPK的表達(dá)抑制SV40 Mes細(xì)胞自噬、促進(jìn)其增殖。
　　第二部分 驗(yàn)證miR-101調(diào)控SV40 Mes細(xì)胞的自噬、增殖能力
　　目的：
　　證明miR-101能調(diào)控高糖條件下SV40 Mes細(xì)胞的自噬、增殖能力。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):同第一部分。
　　2.miR-101抑制高糖環(huán)境下SV40 Mes細(xì)胞的自噬反應(yīng)。分組:NG、HG、miR-10

16、1-mimic+HG、 mimic-control+HG、 miR-101-inhibitor+HG、inhibitor-control+HG共6組。檢測(cè)指標(biāo):a、用透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞的自噬體形態(tài)并計(jì)數(shù);b、用WB測(cè)各組細(xì)胞LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.加入高糖后顯示:miR-101-mimic組SV40 Mes細(xì)胞的自噬體形成標(biāo)志蛋白LC3B自噬水平較高糖組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

17、P＜0.05);而miR-101-inhibitor組LC3B蛋白自噬水平比高糖組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.在透射電子顯微鏡下，加入高糖后miR-101-mimic轉(zhuǎn)染組SV40 Mes細(xì)胞內(nèi)自噬體（以包含未消化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的特殊雙膜結(jié)構(gòu)為特征）個(gè)數(shù)明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;miR-101-inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)自噬體個(gè)數(shù)最多。
　　3.SV40 Mes細(xì)胞在高糖條件下，miR-101-mimic組的PCNA蛋

18、白含量較高糖組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而miR-101-inhibitor組PCNA蛋白含量比高糖組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.用CCK8法檢測(cè)高糖條件下SV40 Mes細(xì)胞增殖水平，加入高糖后，miR-101-mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖水平比高糖組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而miR-101-inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖水平最低。
　　結(jié)論：
　　miR-1