高糖、胰島素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞glut4、p21表達(dá)

1、:www.paper.高糖、胰島素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞GLUT4、P21表達(dá)及細(xì)胞骨架蛋白Factin的影響1黃頌敏2，唐萬(wàn)欣，柳飛，付平，周莉，劉芳四川大學(xué)華西醫(yī)院腎內(nèi)科摘要：摘要：目的探討高糖、胰島素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞（GMC）GLUT4、P21表達(dá)及細(xì)胞骨架蛋白Factin的影響，進(jìn)一步研究上述因子在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的重要作用。方法將培養(yǎng)的鼠1097系膜細(xì)胞分為8組：正常對(duì)照組，生理濃度胰島素組（109M），低濃度胰島素組（108M

2、），高濃度胰島素組（106M），高糖組（30mM），甘露醇組，高糖加高濃度胰島素組，高糖加生理濃度胰島素組。采用RTPCR法檢測(cè)GLUT4mRNA、P21mRNA含量，rhodaminephalloidin染色，激光共聚焦顯微鏡觀察Factin形態(tài)并測(cè)定熒光強(qiáng)度。流式細(xì)胞儀測(cè)各組GMC大小。結(jié)果1、正常系膜細(xì)胞可檢測(cè)到GLUT4mRNA、P21mRNA。2、高糖組GLUT4mRNA表達(dá)明顯下降，P21mRNA表達(dá)明顯增加；不同濃度胰島素

3、刺激GMC中GLUT4mRNA表達(dá)存在濃度—效應(yīng)關(guān)系；P21mRNA表達(dá)越高，細(xì)胞前向角度散射光（FSC）越強(qiáng)，GMC體積越大。3、高糖組Factin熒光強(qiáng)度明顯下降，不同濃度胰島素與Factin熒光強(qiáng)度存在濃度效應(yīng)關(guān)系。4、GLUT4mRNA表達(dá)與Factin熒光強(qiáng)度變化呈同向關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.786（p0.05）。結(jié)論1、高糖刺激導(dǎo)致GMC肥大，P21表達(dá)上調(diào)和GLUT4表達(dá)下調(diào)均參與這一過(guò)程。GLUT4、P21在GMC表達(dá)變化參

4、與了DN早期GMC肥大—腎小球肥大的發(fā)生。2、高糖可抑制GLUT4mRNA表達(dá)及促進(jìn)Factin解聚，胰島素有一定拮抗作用，且呈劑量依賴(lài)性。3、GLUT4、P21、Factin是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的重要因子。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：糖尿病腎?。黄咸烟寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；纖維狀肌動(dòng)蛋白；P21糖尿病腎病（DiabeticNephropathyDN）是主要的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因。DN發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為是多因素共同作

5、用的結(jié)果，其中高血糖的毒性作用是最重要的因素之一。近年來(lái)，在血糖穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用的胰島素反應(yīng)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GlucoseTranspter4GLUT4）正受到人們的重視，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)傳導(dǎo)成為目前研究的熱點(diǎn)。已有研究證實(shí)腎小球系膜細(xì)胞、入球小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，腎小管髓袢升支粗段上皮細(xì)胞中均有GLUT4表達(dá)[1]，GLUT4在DN的發(fā)生發(fā)展中扮演什么角色，目前尚無(wú)人研究。當(dāng)胰島素與細(xì)胞膜受體結(jié)合后，將產(chǎn)生一系列的信號(hào)，刺激細(xì)胞漿中

6、含GLUT4的囊泡易位至細(xì)胞膜從而完成葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K及cblCAP是兩條引起GLUT4易位、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑[23]。這兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑最終要通過(guò)細(xì)胞骨架的基礎(chǔ)蛋白——纖維狀肌動(dòng)蛋白（Factin）作用觸發(fā)GLUT4囊泡易位[4]。DN早期即出現(xiàn)腎小球肥大，其中系膜細(xì)胞肥大起著重要作用，已經(jīng)證實(shí)各種因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響最終發(fā)生在細(xì)胞周期水平[5]。細(xì)胞周期調(diào)控依賴(lài)于一系列細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其中P21是已知

7、的最具廣泛活性的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，P21與系膜細(xì)胞肥大的關(guān)系也是目前研究的熱點(diǎn)。因此，我們?cè)O(shè)想，在高血糖的環(huán)境下，DN的發(fā)生可能與腎小球系膜細(xì)膜GLUT4表達(dá)下調(diào)、Factin影響GluT4易位從而導(dǎo)致GLUT4穩(wěn)定血糖的機(jī)制失調(diào)，以及P21表達(dá)增加導(dǎo)致系膜細(xì)胞肥大。本研究擬用高糖和不同濃度胰島素刺激體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，測(cè)定其GLU4mRNA、P21mRNA、Factin的表達(dá)及變化，從細(xì)胞分子水平進(jìn)一步探討DN的發(fā)生與發(fā)展

8、，從而為防治DN尋找新的理論依據(jù)。材料和方法材料和方法1腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定：大鼠1097系膜細(xì)胞株由中山醫(yī)科大學(xué)腎臟病實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。系膜細(xì)胞培養(yǎng)、傳代，取第4代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，實(shí)驗(yàn)用57代。2實(shí)驗(yàn)分組：將系膜細(xì)胞分為8組（表1）每組設(shè)3復(fù)孔。3細(xì)胞內(nèi)總RNA提取:用Trizol試劑（寶生生物公司）提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)（Beckman1本課題受到教育部博士點(diǎn)重點(diǎn)基金項(xiàng)目資助，編號(hào)20020610078。2通訊作者1

9、:www.paper.2：109M胰島素3：108M胰島素4：106M胰島素5：30mMD葡萄糖6：甘露醇組(25mM甘露醇5mMD葡萄糖)7：30mMD葡萄糖106M胰島素8：30mMD葡萄糖109M胰島素9：βactin[圖3]P21mRNA的表達(dá)正常30mMDGluβactin7Factin熒光染色及熒光強(qiáng)度測(cè)定：在無(wú)菌蓋玻片上接種系膜細(xì)胞，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時(shí)后分組加入各種刺激因素，作用72h后取片。參照Barak等的

10、方法[4]，用rhodaminephalloidin行Factin熒光染色。PBS液洗3次，每次5min，4%多聚甲醛固定5min，0.1%TritonX100處理10min，rhodaminephalloidin（濃度為0.165μmolL）混合，37℃溫度孵育1h，PBS液洗3次，每次5min，緩沖甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組系膜細(xì)胞Factin分布，用Olympus數(shù)碼像機(jī)隨機(jī)記錄圖像，用UVI圖像分析系統(tǒng)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的

11、平均熒光強(qiáng)度。（每孔隨機(jī)選取5個(gè)細(xì)胞，計(jì)算三孔共15個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度）。8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：各組數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（XS）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)之間相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)rs，p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS（11.0版）。結(jié)果2.1高糖、胰島素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞GLUT4mRNA表達(dá)的影響[表1]各組GluT4mRNA的表達(dá)GroupnX—S正常對(duì)照組30.6580

12、.015109M胰島素（生理濃度）30.7340.012108M胰島素31.5150.034106M胰島素31.9560.02730mMD葡萄糖30.3860.021甘露醇組(25mM甘露醇5mMD葡萄糖)30.7270.01130mMD葡萄糖106M胰島素30.8290.014△30mMD葡萄糖109M胰島素30.6820.033△注：與對(duì)照組比較，P0.05；與對(duì)照組比較，P0.01?！髋c高糖組比較，p0.05。由表1可知，體外培養(yǎng)